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目的食管鳞状细胞癌(ESCC)起源于食道上皮细胞,为我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一。由于临床症状不典型等原因,大多数患者就诊时偏晚期,无手术适应症。放化疗是局部晚期食管鳞癌的重要治疗方法。然而,仍有相当一部分患者难免发生肿瘤复发或转移,预后欠佳。目前,寻找放疗抵抗特异性标志物,应用小分子抑制剂,阻断放疗抵抗相关通路,改善射线敏感性,是提高放疗疗效的主要措施之一。此外,肿瘤免疫逃逸也是食管癌发生发展的重要原因,放射治疗可以诱导部分肿瘤细胞免疫原性死亡。进一步增强食管癌细胞的免疫原性则可以促进机体免疫系统的杀伤效果,这也是提高放疗疗效的有效措施之一。本研究选用临床食管癌放疗前后血浆标本,应用高通量组学筛选放疗抵抗差异蛋白,进行验证;然后采用特异性的小分子抑制剂,观察其对放疗敏感性改善情况,阐述相关的机制;同时,我们进一步检测了小分子抑制剂和放疗在诱导食管癌细胞免疫原性死亡中的作用;此外,基于临床组织样本,评估相关的标记物在预测接受放疗的局部进展期食管癌患者预后中的作用。最终,通过本研究,寻找潜在放疗抵抗靶点,深入阐述食管癌放疗抗拒的分子机制,以期为个体化精准放疗提供实验基础和理论指导。方法1.收集局部进展期食管鳞癌放疗前、放疗中、放疗后血浆标本,通过质谱技术检测血浆标本,进行生物信息学分析以筛选放射治疗前后差异表达蛋白;采用酶联免疫分析血浆样本,验证差异蛋白表达情况。2.筛选射线抵抗的食管癌细胞株,给予相应的小分子抑制剂(ERAD抑制剂),MTT法检测细胞增殖情况,应用克隆形成实验及单靶多击模型研究小分子抑制剂对食管癌细胞放疗敏感性的影响;利用小核糖核酸(RNA)干扰基因沉默技术,使射线抵抗蛋白基因沉默,检测食管癌细胞放疗敏感性的改善情况;应用流式检测细胞周期、凋亡情况;使用免疫印迹技术检测并阐明射线抵抗的具体分子机制。3.采用射线照射食管癌细胞,分别检测细胞膜表面钙网蛋白转位情况,细胞外三磷酸腺苷(ATP)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)释放情况,观察肿瘤免疫原性细胞死亡发生情况;联合给予ERAD抑制剂处理食管癌细胞,检测免疫原性死亡水平的变化。4.收集接受放疗的局部进展期食管癌患者病理组织标本,采用免疫组化技术,分析放疗抵抗蛋白表达情况和患者预后之间的相关性。结果1.放疗过程中补体通路和内质网应激通路参与食管鳞癌放射敏感性的调控;而且,这两条通路部分蛋白质含量发生了显著的改变(p<0.05)。内质网应激中,包括未折叠蛋白应答(UPR)通路和ERAD途径与食管鳞癌放疗抵抗密切相关。经验证,放疗前后血浆中免疫球蛋白结合蛋白(BIP)升高的患者疗效欠佳。2.ERAD抑制剂和射线均能够抑制食管肿瘤细胞增殖及克隆形成,诱导细胞凋亡;低于阈值的内质网应激是导致肿瘤细胞放疗耐受的重要机制之一;采用小分子抑制剂阻断内质网应激中的ERAD通路能够改善食管癌细胞放疗敏感性,具体机制为:ERAD抑制剂可增加射线诱导的肿瘤细胞内质网应激水平,UPR通路表现为CHOP诱导的细胞凋亡途径;而且,ERAD抑制剂可显著增加肿瘤细胞的G2/M期阻滞。3.放疗可以诱导食管鳞癌细胞发生免疫原性死亡,以中等剂量的射线照射最为明显;ERAD抑制剂联合放疗(≥6Gy)可显著诱导自噬引发的ATP细胞外释放;可导致强烈的内质网应激来增加钙网蛋白细胞膜转位;可促进肿瘤细胞坏死来增加HMGB1细胞外释放;总之,ERAD抑制剂对放疗诱发的免疫原性死亡有增效作用。4.接受放疗的局部进展期食管鳞癌患者,BIP低表达者的总生存期(OS)明显优于高表达者(p<0.05);BIP是食管癌患者独立的预后因素。结论1.基于质谱分析的食管癌血浆蛋白组学提示内质网应激通路相关蛋白与食管鳞癌放疗敏感性关系密切。2.低于阈值的内质网应激是放疗抵抗的重要原因之一;靶向内质网应激中的ERAD通路可以抑制肿瘤细胞增殖,改善食管癌细胞放疗敏感性。3.ERAD抑制剂可以增加放疗诱导的食管癌免疫原性死亡的发生水平。4.食管肿瘤组织BIP的表达水平与放疗患者预后相关,BIP可作为独立预后因素。