动脉粥样硬化斑块泡沫细胞铁死亡对胞葬的影响及槲皮素的改善机制

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目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)中胞葬受损,大量死亡细胞的积累是坏死核心和易损斑块形成的重要原因。AS中泡沫细胞存在铁沉积以及脂质过氧化,提示泡沫细胞铁死亡可能参与AS的发生发展。本研究旨在探讨AS背景下泡沫细胞铁死亡对胞葬的影响,以及具有良好抗AS作用的植物化学槲皮素在此方面的调节和保护效应及相关机制。方法:动物实验:(1)60只体重为18-20 g的5-6周龄雄性SPF级Apo E-/-小鼠按体重随机分为对照组(CON)、高脂组(HFD)、高脂槲皮素组(HFD+Q),每组20只。高脂饲料中脂肪含量为21%,胆固醇含量为1.25%;槲皮素给予量为100 mg/kg·bw。各组小鼠连续喂养16周后,解剖分离主动脉,收集小鼠血清样本。(2)主动脉油红O染色和苏木素-伊红(HE)染色观察动脉斑块形成和病理改变;测定血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和铁水平;普鲁士蓝染色检测主动脉铁水平;免疫荧光染色观察主动脉中巨噬细胞标志物F4/80和谷胱甘肽过氧化酶4(GPx4)、谷氨酸/胱氨酸转运体(x CT)的共定位;免疫组织化学观察主动脉中核因子E2相关因子2(Nrf2)变化情况。细胞实验:(1)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL,50μg/m L)处理的RAW264.7细胞,首先加入槲皮素(Q,20μmol/L)进行油红O染色和TG检测评价细胞泡沫化程度,进一步在ox-LDL基础上加入铁死亡抑制剂(Fer-1,2μmol/L)、去铁胺(DFO,10μmol/L)、柠檬酸铁铵(FAC,50μmol/L)或槲皮素测定乳酸脱氢酶(LDH)释放水平,western blot测定铁死亡相关蛋白GPx4、x CT的表达。(2)应用铁死亡激动剂RSL3(4μmol/L)和凋亡激动剂STS(1μmol/L)处理RAW264.7细胞,流式细胞仪检测不同死亡形式细胞的胞葬率。对ox-LDL处理的RAW264.7细胞加入FAC、Fer-1、DFO及槲皮素,观察ox-LDL处理的RAW264.7细胞调控铁死亡或经槲皮素干预后胞葬率的变化。(3)RAW264.7细胞在ox-LDL处理、槲皮素干预的同时,加入Nrf2抑制剂ML385(5μmol/L),观察LDH释放与细胞内GSH、MDA和不稳定铁池(LIP)水平及Nrf2、铁死亡相关蛋白表达和胞葬率的变化。在此基础上提取并培养Nrf2flox/flox和Nrf2flox/floxLyz2-Cre小鼠的骨髓源巨噬细胞(BMDM)代替RAW264.7细胞观察上述部分指标的变化。结果:1.与对照组相比,高脂组Apo E-/-小鼠主动脉斑块面积明显增加(P<0.01),血清中TG、TC水平明显增高(P<0.001)。槲皮素干预有效减少高脂诱导的主动脉斑块面积(P<0.05),显著降低血清TG、TC水平(P<0.01)。2.与对照组相比,高脂组Apo E-/-小鼠血清GSH水平降低(P<0.05),血清MDA、铁水平增加(P<0.05),主动脉铁增多,斑块处巨噬细胞标志物F4/80与铁死亡相关蛋白GPx4和x CT的荧光共定位减弱。槲皮素干预显著逆转高脂组小鼠血清和主动脉铁死亡相关指标的改变。3.槲皮素干预减少ox-LDL诱导的RAW264.7细胞内脂质沉积和TG水平,减轻巨噬细胞泡沫化程度。ox-LDL处理导致RAW264.7细胞LDH释放增加(P<0.05),GPx4、x CT表达下调(P<0.01)。FAC联合ox-LDL处理进一步加重ox-LDL诱导的LDH释放(P<0.05),降低GPx4和x CT的表达(P<0.05)。针对ox-LDL孵育的RAW264.7细胞,铁死亡抑制剂Fer-1、铁螯合剂DFO或槲皮素处理均能较好地缓解ox-LDL诱导的LDH释放(P<0.05),恢复GPx4、x CT的表达(P<0.05)。4.RAW264.7细胞经RSL3和STS处理后,胞葬率均升高(P<0.001),但RSL3诱导的胞葬率明显低于STS(P<0.01)。ox-LDL处理后的RAW264.7细胞胞葬率较对照组升高(P<0.05),但FAC联合ox-LDL处理后胞葬率较ox-LDL组无显著性差异。Fer-1、DFO或槲皮素处理ox-LDL孵育的细胞后均降低了胞葬率(P<0.01),减轻了胞葬负荷。5.槲皮素干预提高了高脂喂养的Apo E-/-小鼠主动脉Nrf2的表达。同样,槲皮素干预增加了ox-LDL处理的RAW264.7细胞中Nrf2的表达(P<0.001)。加入Nrf2抑制剂ML385后,逆转了槲皮素对ox-LDL处理的RAW264.7细胞中GSH、MDA、LIP、GPx4、x CT、ACSL4等铁死亡相关指标的改变(P<0.05),逆转了槲皮素对胞葬负荷的减轻作用(P<0.05)。在Nrf2flox/floxLyz2-Cre小鼠BMDM中,槲皮素干预对ox-LDL诱导的MDA、GSH和LIP水平均无明显改变。结论:AS斑块中泡沫细胞出现铁死亡,而铁死亡细胞不易被清除,其积累可能加重了胞葬负荷并加剧AS病变。槲皮素的抗AS效应可能与其上调Nrf2抑制泡沫细胞铁死亡,进而减轻胞葬负荷有关。
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