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目的:顺铂是治疗非小细胞肺癌的有效药物之一,但临床上发现随着治疗周期次数的增加,癌细胞对顺铂的敏感性逐渐降低,最后出现对顺铂耐受。目前普遍认为肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage,TAM)作为肿瘤微环境的重要基质细胞,不仅直接参与肿瘤血管的形成,而且通过与肿瘤细胞间的相互作用,介导肿瘤细胞的间质转化,促进肿瘤转移。根据巨噬细胞的表型和功能,巨噬细胞分为M1型和M2型;且近期的研究表明M1和M2型巨噬细胞在肿瘤组织中均有分布。但是M1和M2型巨噬细胞对肺癌细胞的增殖、迁移及对顺铂敏感性的作用如何还鲜有报道。本实验采用A549细胞及其荷瘤小鼠为模型,观察了M1和M2型巨噬细胞及其分泌的外泌体在体内外对A549细胞的增殖、迁移及对顺铂敏感性的作用,目的是深入了解不同类型的巨噬细胞对顺铂治疗的影响,为靶向调节巨噬细胞促进顺铂治疗效果提供实验数据。方法:1 M1和M2巨噬细胞的诱导体外培养人单核细胞白血病细胞系THP-1,PMA(15μg/ml)诱导36h,去掉含PMA的培养基并用PBS洗一遍,加入新鲜完全培养基继续培养12h,贴壁的细胞为M0。1.1 M1细胞的诱导:贴壁细胞用含1μg/ml脂多糖(LPS)和20ng/ml人重组干扰素-γ(IFN-γ)的完全培养基培养24h,然后去掉培养上清,PBS洗1次,加入新鲜完全培养基培养24h,收获上清经ELISA测定IL-1β水平,收集细胞提取总蛋白,Western blot分析i NOs(诱导型一氧化碳合酶)、Arg-1(精氨酸酶-1)的表达。1.2 M2细胞的诱导:贴壁细胞用含20ng/ml IL-4的完全培养基培养24h,然后去掉培养上清,PBS洗1次,去掉残存的细胞因子或LPS,加入新鲜完全培养基培养24h,收获上清(ELISA测定IL-1β),收细胞,WB分析i NOs、Arg-1的表达。2外泌体的制备及电镜观察收集M1型和M2型巨噬细胞培养上清,差速离心法分离提取外泌体(M1/exo,M2/exo):2000×g,10min,10,000×g,1h;然后将上清超高速110,000×g离心16 h,以少量PBS重悬所得沉淀。最后用磷钨酸负染外泌体并在透射电镜下观察外泌体的形态,并以Nanodrop进行定量。3观察M1/exo,M2/exo对A549细胞增殖、迁移及对顺铂敏感性的影响3.1 Dil荧光染料标记M2/exo:取11.5mg/ml的M2/exo0.5ml,加Dil荧光染料(50μg/ml),25μg,放培养箱中作用30分钟,取出放入小的超速离心管中,用PBS补满,上超速离心机,2×105g转速,2小时,离心后弃上清,去掉游离的染料,要沉淀外泌体。将荧光标记的外泌体作用于A549细胞24h,荧光显微镜下观察A549对外泌体的摄取。3.2体外培养A549细胞,分别用终浓度50μg/ml的M1/exo或M2/exo刺激A549细胞,Transwell细胞迁移实验、划痕试验分别观察两种不同外泌体对A549迁移能力的影响。3.3用艾森生物实时细胞分析技术(RTCA),即实时无标记细胞分析法,检测M1/exo或M2/exo刺激对A549增殖和对顺铂耐药性的影响。4观察M1/exo或M2/exo对A549细胞的E-Cadherin、N-Cadherin、PTEN、AKT/p-AKT蛋白表达的影响体外培养A549细胞,M1/exo或M2/exo刺激72h,收集细胞并提取总蛋白,Western Blot分析上述蛋白表达。5 M1及M2型巨噬细胞及其分泌的外泌体影响A549荷瘤小鼠肿瘤生长及对顺铂敏感性的观察5.1细胞培养与计数收集体外培养的处于对数生长期A549计数,调整细胞密度为7×107/ml。同1.1和1.2诱导M1型和M2型巨噬细胞,计数后,分别调整细胞密度为7×107/ml。5.2荷瘤小鼠的制备5.2.1实验分组将5-6周的雌性BALB/c裸鼠分为10组,每组5只。第一组:A549荷瘤对照组。将体外培养的A549移植到小鼠右侧腋下,7×106/鼠。第二组:A549+M1组。取等量的A549和M1型细胞(均100μl)混合后,移植到小鼠右侧腋下。第三组:A549+M2组。取等量的A549和M2型细胞(均100μl)混合后,移植到小鼠右侧腋下。第四组:A549+顺铂。右侧腋下移植A549,7×106/鼠,按Q4d×3的方案腹腔注射顺铂(5mg/kg)。第五组:A549+M1+顺铂。同上移植A549和M1,腹腔注射顺铂。第六组:A549+M2+顺铂。同上移植A549和M2,腹腔注射顺铂。第七组:A549+M1/exo。同上移植A549,在移植的当天,在注射肿瘤细胞的部位注射50μg外泌体。隔日一次,连续3周。第八组:A549+M2/exo。同上移植A549和外泌体注射。第九组:A549+M1/exo+顺铂。同上。第十组:A549+M2/exo+顺铂。同上。5.3观察肿瘤瘤重在荷瘤的第四周,解剖荷瘤小鼠,分离肿瘤组织并称重。结果:1 ELASA法检测诱导的M1型巨噬细胞上清液中IL-1β含量低于M2型巨噬细胞组,差异具有统计学意义(P<0.05)。M1型巨噬细胞i NOs(诱导型一氧化碳合酶)蛋白表达量明显高于M2型巨噬细胞(P<0.05);Arg-1(精氨酸酶-1)蛋白表达量低于M2型巨噬细胞(P<0.05)。体外成功诱导M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞。2电镜观察到大小均一的、直径约为100 nm大小的圆形或椭圆形囊泡。3倒置荧光显微镜下观察到A549细胞可以摄取外泌体。4划痕实验观察到,PBS、M1/exo对A549的横向迁移没有明显影响(P>0.05);M2/exo可促进A549细胞的横向迁移(P<0.05)。Transwell实验显示,M2/exo较对照组及M1/exo组明显促进A549细胞的纵向迁移(P<0.05),M1/exo的作用不明显(P>0.05)。细胞增殖实验显示M2/exo可促进A549细胞的增殖和降低对顺铂的敏感性。5 Western blot结果显示,与PBS及M1/exo相比较,M2/exo明显上调A549细胞N-Cadherin的表达(P<0.05),下调E-Cadherin表达水平(P<0.05);表明M2/exo能够促进A549发生间质转化和迁移。A549细胞经M1/exo和M2/exo刺激后,PTEN表达水平在M2/exo刺激组明显低于M1/exo刺激组和对照组(P<0.05)。p-AKT(p-AKT/AKT灰度值)活力水平在M2/exo刺激组增高,且显著高于M1/exo刺激组和对照组(P<0.05)。6小鼠荷瘤实验结果显示1)A549+M2细胞组荷瘤小鼠的瘤重明显大于A549组和A549+M1细胞组,均有显著差异(均为P<0.01)。A549+M1细胞组和A549组瘤重比较无显著差异(P>0.05)。以上结果显示M2细胞可以促进A549瘤体增殖。2)A549细胞、A549+M2细胞及A549+M1细胞三组荷瘤小鼠分别经顺铂治疗后,观察到A549+M2细胞组瘤重最大,与其它两组均有显著性差异(均为P<0.05)。而M1+A549与A549细胞组的瘤重无统计学差异(P>0.05)。3)给A549荷瘤小鼠瘤周注射M2/exo组瘤重最大,与注射M1/exo和PBS组的瘤重相比,均有统计学差异(均为P<0.05);A549荷瘤小鼠瘤周注射M1/exo和PBS组的瘤重没有显著差别(P>0.05)。4)A549荷瘤小鼠瘤周注射M2/exo后,对顺铂的治疗敏感性较差,该组荷瘤小鼠瘤重与注射M1/exo和PBS组的瘤重相比,均有统计学差异(均为P<0.05);而M1/exo和PBS均不影响A549细胞对顺铂的敏感性。结论:1 M2型巨噬细胞可促进A549细胞增殖、迁移,并降低对顺铂敏感性。2 M2型巨噬细胞产生的外泌体可促进A549细胞增殖、迁移,并降低对顺铂敏感性。