甘蔗(Saccharum officinarumL.)是生长于热带和亚热带的高光效C4植物,是世界上重要的糖料作物。蔗糖是甘蔗光合作用的主要产物,也是运输、分配及储存的主要形式。蔗糖从源组织运输到库组织后,一部分被储存,一部分不能直接被植物体利用,而是被水解成单糖,在单糖转运蛋白的协助下,转运到库组织,再被其吸收利用,促进植物体生长发育,同时参与胁迫应答,维持细胞稳态。所以,分离鉴定甘蔗单糖转运蛋白,为揭示甘蔗体内糖分的转运分配提供理论指导。1、本文通过NCBI公布的同源物种设计特异性引物并克隆出甘蔗单糖转运蛋白基因ShHXT1和ShHXT2的cDNA,将其编码的氨基酸序列与不同作物的HXTs进行一致性分析,结果发现,这两种氨基酸分别与玉米的HXT6和GT4的一致性最接近。甘蔗ShHXT1包含一个1473bp的ORF,编码460个氨基酸,具有10个跨膜区;甘蔗ShHXT2包含一个1623bp的ORF,编码540个氨基酸,具有12个典型的跨膜区。2、目的基因的亚细胞定位分析:构建GFP融合表达载体:ShHXT1-GFP/ShHXT2-GFP。利用农杆菌注射洋葱表皮细胞的方法进行亚细胞定位,发现它们属于膜蛋白。3、体外酵母功能验证:构建酵母表达载体:p413-pHXT7-ShHXT1/p413-pHXT7-ShHXT2。它们能够恢复己糖吸收缺陷酵母突变体EBY.VW4000的果糖吸收功能,且具有特异性,不能转运葡萄糖、甘露糖、半乳糖等其他单糖。4、荧光定量PCR对目的基因在不同组织的表达模式进行分析:ShHXT1和ShHXT2在甘蔗根、茎、叶中均有表达,这说明它们属于组成型表达。且它们在未成熟组织中表达量高,由此推测它们在快速生长器官中表达高,促进其生长发育。5、荧光定量PCR对目的基因在冷胁迫处理甘蔗组培苗中的表达模式进行分析:ShHXT1和ShHXT2表达量随处理时间的增长而增加。在处理6h时,它们都被快速诱导,之后表达量快速增加。这表明目的基因遇冷胁迫时,可能参与体内渗透势的调节,维持细胞稳态。6、荧光定量PCR对目的基因在甘蔗不同病叶的表达模式进行分析:ShHXT1和ShHXT2在甘蔗褐条病叶、甘蔗赤腐病叶、甘蔗黑素病叶的表达量都高于甘蔗健康叶。由此推测,在生物胁迫下,它们被激活,可能为病原微生物提供碳源。7、叶盘法遗传转化烟草:PCR检测获得9株转ShHXT2阳性苗。选择一个转基因株系进行冷胁迫处理,发现该目的基因的表达量随处理时间的增长而增加,这更进一步证实该基因可能参与运输可溶性糖来调节植物体内渗透势,维持其稳态。8、农杆菌介导法遗传转化甘蔗:PPT筛选、PCR检测获得12株ShHXT2阳性苗。