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研究目的：中性粒细胞减少症是由于外周血中性粒细胞数量减少而出现的一组综合征,是肿瘤治疗中最常见的并具有潜在的致命性的并发症。统计表明中性粒细胞减少症在接受化疗的实体肿瘤病人中发生率为10%-20%,院内的死亡率达到9.8%。尽管重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)通过促进人造血干细胞的粒系分化而发挥较好的的预防中性粒细胞减少症的作用,但是其治疗作用并不明显。因此,寻找高效的诱导造血干细胞分化为中性粒细胞的药物是解决上述问题的关键。维甲酸(RA)通过激活配体依赖性的转录激活因子RARα,促进白血病的原始粒细胞和造血干细胞的粒性分化。维甲酸类似物AM80是特异性的RARa受体激动剂,研究表明AM80的诱导早幼粒细胞白血病细胞分化能力大约是RA的10倍并且毒性较低。2005年AM80在日本上市用于复发性难治性的急性早幼粒细胞白血病的治疗,但是AM80对造血干细胞分化的作用则未见报道。本文首先考察比较了AM80和G-CSF诱导造血干细胞分化的能力,其次比较AM80和G-CSF诱导造血干细胞分化生成中性粒细胞的杀菌功能,最后对杀菌机制进行研究。本研究对于将AM80作为一种成本较低的治疗药物运用于中性粒细胞减少症具有重要的指导意义。方法和结果：我们首先考察了AM80, G-CSF以及其他的维甲酸受体激动剂对造血干细胞CD34+细胞的诱导分化作用。应用吉姆萨染色观察细胞形态学改变,结果显示AM80诱导产生的成熟粒细胞的比例明显高于G-CSF,表明AM80诱导造血干细胞CD34+细胞分化的能力强于G-CSF.台盼蓝拒染法和细胞计数结果显示与G-CSF类似,AM80(2.5nM)在促进CD34+细胞增殖的同时细胞的死亡率低于10%。我们进一步采用透射电镜观察G-CSF诱导生成的粒细胞(GIN), AM80诱导生成的粒细胞(AIN)以及外周血中性粒细胞(PBN)的细胞超微结构,图片显示AIN中的颗粒蛋白数量多于GIN。我们随后检测大肠杆菌(E.coli DH5a)刺激下GIN, AIN和PBN脱颗粒的能力。Western blotting结果显示细菌刺激下AIN产生并分泌的颗粒蛋白髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO),乳铁蛋白(lactoferrin),人类内源性抗菌肽(LL-37),明胶酶(MMP-9)的水平均高于GIN。以上结果显示AM80促进粒细胞分化和粒细胞颗粒蛋白产生的能力强于G-CSF,提示AM80诱导产生的高水平分化可能转化为对抗细菌感染的免疫功能。为了证明这一假设,我们采用吞噬和杀伤细菌试验评价GIN, AIN和PBN杀伤大肠杆菌和金黄色葡萄球菌能力,结果显示细胞与细菌共孵育一定时间后,AIN和PBN细胞外细菌数显著低于GIN,细胞内存活细菌数同样低于GIN.基于以上数据计算细胞吞噬细菌数和杀死细菌的数量,结果显示AIN吞噬和杀伤细菌的数量明显高于GIN。同时我们采用LIVE/DEAD BacLight细菌活性测定试剂盒结合激光共聚焦显微镜观察细胞内细菌的存活状态,结果表明GIN中的活菌数远多于AIN和PBN, AIN和PBN中杀死的细菌数远多于GIN。透射电镜观察细菌感染的细胞同样也显示GIN中存在大量存活的细菌,而AIN和PBN中则没有。以上结果均证实了AIN吞噬和杀伤细菌的能力强于GIN。为了深入研究AM80增强中性粒细胞的杀伤细菌功能的机制,我们采用流式细胞术考察GIN, AIN和PBN表面抗原CD18-CD66, CD11b-CD66的共表达水平,检测结果表明AIN细胞免疫抗原CD66a+CD18+和CD66b+CD18+的比例分别为40%和60%,而GIN细胞CD66a+CD18+和CD66b+CD18+的比例则分别为13%和34.9%。同样的,AIN细胞CD66a+CD11b+和CD66b+CD11b+的比例为40.9%和40%, GIN细胞则分别为20.2%和18%。以上数据结果显示AIN细胞表面CD18-CD66和CD11b-CD66的表达水平高于GIN。这一结果提示AM80在促进造血干细胞分化的同时也促进了CD18-CD66信号网络的完善从而杀伤细菌。为了证实这一想法,我们采用CD18抗体中和CD18功能阻断CD66-CD18信号通路检测GIN, AIN和PBN的杀伤大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性,结果显示加入CD18抗体后,AIN和PBN吞噬和杀伤细菌的能力显著下降。提示CD18-CD66信号通路在AM80诱导的中性粒细胞免疫功能的增强中发挥的重要作用。我们进一步采用中性粒细胞减少症小鼠模型考察G-CSF和AM80在体内诱导分化的中性粒细胞的杀菌能力,实验结果显示尽管G-CSF能够促进外周血中性粒细胞的大量产生,但是AM80在小鼠中动员的中性粒细胞吞噬和杀伤细菌的能力强G-CSF.结论：本论文首次研究了AM80诱导造血干细胞分化的中性粒细胞的杀菌功能并对其机制进行了初步的探讨。AM80诱导粒细胞分化能力强于G-CSF,AIN在体外和中性粒细胞减少症小鼠模型中杀菌活性与PBN或者MPBN类似并强于GIN,可能是由于CD66和CD18相互协同作用加强了中性粒细胞的免疫功能。这一研究将为AM80作为一种低成本的治疗方法用于诱导造血干细胞粒性分化进而治疗中性粒细胞减少症提供了实验依据。