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目的:第一部分:TMPyP4 [四-(N-甲基-4-吡啶基)卟啉]在不同溶剂中吸收波长及激发波长的测定。第二部分:检测TMPyP4对体外Tca8113细胞的光动力杀伤效应(Photodynamic Therapy Mediated by TMPyP4,TMPyP4-PDT),同时初步探讨细胞死亡机制。方法:第一部分:1、将TMPyP4在电子天平上称重后在无菌条件下取出1mg,分别稀释于100ml双蒸水及含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,使TMPyP4在两种溶液中浓度一致(浓度约6.5μM),在室温下用紫外可见分光光度仪UV-265在波长360nm～700nm的范围内分别检测TMPyP4的电子吸收波长及吸光度值(A)。2、选取最大吸光度值时的光波波长对TMPyP4(浓度约6.5μM)的RPMI-1640培养液进行激发检测,检测TMPyP4在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中的激发波长及荧光强度,待测溶液用逐步稀释法配置。第二部分:1、将Tca8113细胞复苏后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液置于5%CO2、饱和湿度、37℃恒温孵箱中培养、传代,测定细胞生长曲线。2、取指数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化后充分吹打成单细胞悬液,接种于96孔培养板,5%CO2、37℃孵箱中培养24h贴壁,弃去上清液,加入含不同TMPyP4浓度的RPMI-1640培养液200μl继续培养4h,经不同能量的580nm波长激光照射后继续培养24h,MTT法测OD值,并计算杀伤率。3、将处理后的细胞置于倒置显微镜下观察后,用0.25%胰蛋白酶消化,一部分用冷的PBS洗2次,加入Annexin-V(200μg/ml)和PI(50μg/ml)避光反应后,立即进行流式细胞定量检测(一般不超过lh)。另一部分行HE染色显微镜下观察。结果第一部分:TMPyP4的双蒸水溶液呈现单一吸收峰,峰值出现在421.6nm。TMPyP4的RPMI-1640溶液呈现双吸收峰,峰值出现在422.8nm及557.8nm,且557.8nm处吸收峰峰值明显高于422.8nm处吸收峰峰值。因本实验用激光仪的固定波长分别为470nm、580nm及630nm。故根据上述检测结果选用激光波长580nm作为激发波长。在波长为580nm的激光激发下,可见TMPyP4的RPMI-1640溶液在580nm波长处出现最大吸收峰。第二部分:1、单纯PDT对细胞均无明显杀伤作用。2、不同浓度的TMPyP4在不同剂量的激光作用下对细胞均有不同的杀伤作用,杀伤曲线呈现“S”形。在一定浓度范围内,TMPyP4-PDT对人舌癌Tca8113细胞生长增殖的抑制作用和诱导凋亡作用随着浓度和光照能量的增加而增强。TMPyP4-PDT对人舌癌Tca8113细胞有明显的杀伤作用,并在一定范围内呈光剂量和浓度剂量依赖性。3、中度PDT强度及TMPyP4剂量时,细胞死亡机制以凋亡为主,重度PDT强度及TMPyP4剂量时细胞死亡机制以坏死为主。结论第一部分:TMPyP4在不同溶液中呈现不同的吸收峰值,表明溶液PH值及离子浓度对TMPyP4的吸收波长有明显影响。本实验选用激光波长580nm条件下对样品进行激发,样品在相同波长处出现峰值,表明样品荧光性很弱或无荧光。第二部分:应用TMPyP4对Tca8113细胞体外行PDT有明显的杀伤效应,而且杀伤效应与PDT强度及TMPyP4浓度相关。中度PDT强度及TMPyP4剂量时,细胞死亡方式以凋亡为主,重度PDT强度及TMPyP4剂量时细胞死亡方式以坏死为主。