分泌型Hedgehog (Hh)家族在脊椎动物和非脊椎动物的胚胎发育过程中发挥着重要作用。脊椎动物Hh信号功能的缺失导致很多发育畸形,包括前脑无裂畸形、多指/趾畸形、颅面缺损和骨髂形成缺损。同时,Hh信号通路的异常激活也与很多类型的人类恶性肿瘤有关,如脑胶质瘤、髓母细胞瘤、食管癌、直肠癌、小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌。因此全面了解Hh信号转导的分子机制,不仅可以阐明胚胎发育的分子机制,同时也可以预防和治疗Hh相关的肿瘤。在脊椎动物,Hh配体与细胞表面的受体Patched (Ptch)结合,这一结合可阻止Ptch对Smoothened (Smo)蛋白的抑制,从而允许Hh通路得以激活。Hh信号通路有3个Gli转录因子对其进行调节：Gli1、Gli2、Gli3。其中,Gli2、Gli3具备双重转录活性,在有Hh信号存在时为激活状态(Gli2A/Gli3A),在无Hh信号时经蛋白酶水解加工成为抑制状态(Gli2R/Gli3R)。Gli1是Gli2A/Gli3A的直接作用转录基因,只具有激活子功能。Gli2是调节Hh信号通路的主要的转录激活子。目前,Hh信号和蛋白修饰物如何调节Gli蛋白的功能尚未得到完全了解。小泛索样修饰蛋白(Sumo)是一个有100个氨基酸的多肽,可通过与泛素化类似的方式与靶蛋白共价结合。Sumo修饰对靶蛋白的功能有多种效应。比如,转录因子Sumo化修饰之后大多会使转录过程受抑制,但是偶尔也会发现它有激活转录过程的效应。本次研究通过细胞培养实验及转基因小鼠在体实验,探讨了Sumo与Gli2转录因子的相关性、Sumo化修饰对Gli2蛋白转录活性的影响及影响这一修饰的因素及作用机制。第一章Sumo与转录因子Gli2的相关性研究第一节体内实验中Gli2蛋白与Sumo的相关性研究[目的]探究在体内可与Gli2蛋白相互作用的修饰蛋白,证实Gli2蛋白可以发生Sumo化修饰。[方法]取胎龄10.5天的野生型小鼠胚胎肢芽,将其中的信使RNA(mRNA)分离出来,反转录得到野生型小鼠肢牙cDNA文库,将其重组入Pjp4-5载体。(?)Gli2蛋白羧基末端片段Gli2-584-1024aa来构建诱饵质粒pN lex-Gli2-584-1024aa,使用酵母双杂合筛选法筛选小鼠肢芽cDNA文库,寻找可与Gli2相互作用的修饰蛋白。[结果]通过酵母双杂合系统筛选胎鼠肢芽cDNA文库得到两个基因编码的的蛋白可与Gli2相互作用,它们是Sumo2和Piasl(一个Sumo E3结合酶)。能过该实验证实在体内Gli2蛋白存在Sumo(?)修饰。[讨论]哺乳动物细胞培养结果显示,通过免疫共沉淀方法未能证实Gli2与Sumo2或Pias1存在相互作用,提示我们,这一相互作用过程很短暂。第二节HEK293培养细胞内Gli2蛋白与Sumo的相关性研究[目的]探究在体外培养细胞中Gli2蛋白是否发生Sumo化修饰,在PDD (Gli2羧基端的一个结构域-processing determinant domain蛋白加工决定域)结构域内的两个Sumo化位点是否被Sumo修饰。[方法]1、将HA标记的Sumo2基因HA-Sumo2、Gli2基因分别单独及共同在细胞中表达,将细胞裂解提取蛋白,使用Gli2抗体对细胞蛋白进行免疫沉淀作用,使用HA抗体进行免疫印迹实验,检测细胞中Sumo与Gli2蛋白是否存在相互作用；2、将UBC9基因(E2Sumo(?)合酶)和UBC9DN基因(UBC9的负性结构)分别与HA-Sumo2基因、Gli2基因一起在细胞中表达,将细胞裂解提取蛋白,使用Gli2抗体对细胞蛋白进行免疫沉淀作用,使用HA抗体进行免疫印迹实验,检测有无Sumo结合酶基因共表达的细胞中Sumo化的Gli2蛋白表达量是否有区别；3、将GST融合野生型PDD基因、变异彗PDD基因(PDD中两个Sumo化位点突变)分别与HA-Sumo2基因一起在细胞中表达,将细胞裂解提取蛋白,经GST融合蛋白沉降技术沉降蛋白,使用HA抗体进行免疫印迹实验,检测有无Sumo化位点突变的PDD基因共表达的细胞中Sumo化的Gli2蛋白表达量是否有区别。[结果]1、只有当HA-Sumo2与Gli2在细胞中共表达时才能检测至Sumo化的Gli2蛋白的免疫反应信号,各自单独表达时则不能；2、将UBC9与Gli2、Sumo2共表达时可显著提高Gli2蛋白Sumo化修饰的水平,而UBC9DN与上述两个基因共表达时则完全抑制Gli2蛋白Sumo化修饰；3、Gli2蛋自Sumo(?)修饰在野生型PDD表达的细胞可以监测到,但在单个或两个Sumo化位点突变的变异型PDD表达的细胞Sumo七修饰显著减少或彻底消失。[讨论]因为免疫沉淀反应发生在蛋白变性以后,所以实验1中检测到的信号应该是Sumo化修饰的Gli2,而不是与Gli2相互关联的蛋白；实验2表明Gli2蛋白Sumo化修饰是特异性的；实验3表明在细胞内PDD结构域中两个Sumo化位点被Sumo修饰。第二章体内外研究中Sumo化修饰对Gli2蛋白转录活性的影响第一节体内实验中Sumo化修饰对Gli2蛋白转录活性的影响[目的]探究Sumo(?)(?)修饰在体内Hh信号通路中的作用及在体内对Gli2蛋白转录活性的影响。[方法]制备携带变异型Gli2基因Gli2K2R的突变小鼠(将Gli2K630、K716位置的Sumo化位点突变),选取野生型和突变型E10.5胚胎,提取蛋白,用包含特异的Gli结合位点的双链寡核苷酸将Gli2蛋白富集浓缩,免疫印迹分析使用Gli2抗体,检测该突变小鼠体内Gli2蛋白加工过程是否受影响：其次测定发育中的胎鼠神经管上神经元细胞的特异性分化和图式发育(该过程与Hh信号通路有密切关系)：雌鼠受孕10.5天后,将其处死,收胚胎固定、包埋,制备冰冻切片,使用相应抗体对组织切片行免疫染色,荧光显微镜下观察切片。[结果]1、成功制矫Gli2K2R突变小鼠后,检测突变小鼠体内Gli2蛋白表达水平,结果表明突变体Gli2K2R与野生型Gli2蛋白表达水平相当。2、在野生型胚胎,底板、V3祖细胞、运动神经元在腹侧神经管的特定区域特化和图式发育。他们分别可被转录因子FOXA2, NKX2.2,and HB9and IS11表达标记。NKX6.1的表达从底板覆盖至V1祖细胞,PAX6、PAX7(?)的表述位于背侧神经管,他们两个分别在腹侧神经管的大部分和全部区域表达缺失,因为他们的表达被Hh信号抑制。与野生型胚胎相比,这些转录因子在突变型Gli2K2R纯合子胚胎神经管上的表达和图式发育无明显差别。使用lacZ报告基因嵌入Ptch1位置,Ptch1-lacZ在Gli2突变型胚胎神经管上的表达与野生型Gli2胚胎相比轻微增高,并且在背侧分布更广。[讨论]Ptch1是Gli2转录作用的靶基因,Ptch1表达增强表明Gli2转录活性增强。因此,该实验表明在小鼠体内,突变型Gli2K2R活性比野生型Gli2轻微增高,表明在体内Sumo(?)修饰抑制Gli2转录活性。第二节细胞培养研究中Sumo化修饰对Gli2蛋白转录活性的影响[目的使用鸡胚肢芽原代细胞微团培养,体外实验中测定Sumo修饰对于Gli2蛋白转录活性的影响。[方法]制务携带两个Sumo化位点K630、K716单个或全部突变的变异型Gli2基因的载体质粒(pRK Gli2K630R、pRK Gli2K716R、pRK Gli2K630/716R),将荧光素酶报告基因质粒、海肾荧光素酶内参质粒、pRK-Gli2及上述携带变异Gli2基因的质粒转染入鸡胚肢芽微团培养细胞,培养36小时后裂解细胞,使用双荧光索酶报告基因检测盒检测各类转染细胞荧光素酶活性,与海肾荧光素酶活性标准化后,绘制荧光素酶相对活性图表。[结果]过度表达的野生型Gli2蛋白使报告基因活性增高约10倍,Gli2K630R、 Gli2K716R蛋白使报告基因活性增高的程度比野生型Gli2蛋白轻微增高,而Gli2K630/716R蛋白使报告基因活性增高约30余倍。[讨论]这些结果表明,Sumo化修饰使Gli2转录活性受到抑制。在培养细胞中,单个Sumo化修饰位点作用不明显而各个Sumo化修饰位点相互协同,共同作用,对Gli2转录活性起明显抑制作用。第三章Gli2蛋白Sumo化修饰的影响因素及作用机制研究第一节Gli2蛋白Sumo化修饰的影响因素[目的]PKA磷酸化可抑制Gli2蛋白活性,而Hh信号可促进Gli2蛋白活性激活,因此我们想知道Gli2蛋白Sumo化修饰是否也会受PKA磷酸化和Hh信号的影响[方法]1、使用鸡胚肢芽原代细胞微团培养,将野生型Gli2基因及6个磷酸化位点中单个或多个位点突变的变异型Gli2基因分别与HA-Sumo2(?)基因一起在鸡胚肢芽微团培养细胞中表达,将细胞裂解提取蛋白,用Gli2抗体对细胞蛋白进行免疫沉淀作用,用HA抗体行免疫印迹实验,测定不同磷酸化位点突变情况下Gli2蛋白Sumo(?)(?)修饰水平的变化；2、将Gli2基因和=(?)HA-Sumo2基因单独或一起在鸡胚肢芽微团细胞中表达,加入ShhN条件培养液,培养过夜后裂解细胞提取蛋白,用Gli2抗体对细胞蛋白进行免疫沉淀作用,用HA抗体进行免疫印迹实验,测定Hh信号对Gli2蛋白Sumo化修饰水平是否有影响。[结果]1、在磷酸化位点突变的Gli2基因表达的细胞中,与野生型Gli2蛋白Sumo(?)(?)修饰的水平相比,变异型Gli2P5-6蛋白Sumo化修饰水平略降低,变异型Gli2P1-4蛋白Sumo(?)修饰水平降低明显,变异型(Gli2P1-6蛋白Sumo化修饰水平降低最为明显。2、对表达Gli2基因和HA-Sumo2基因的细胞使用ShhN条件培养液,施加Hh信号刺激,与使用普通培养液表达相同基因的细胞相比,Gli2蛋白Sumo(?)(?)修饰水平降低。[讨论]这些结果显示,6个PKA磷酸化位点的Hh信号刺激都可以抑制Gli2蛋白Sumo化修饰作用,提示我们,PKA对Gli2蛋白的磷酸化过程对Gli2蛋白Sumo化修饰有正性调节作用。第二节Gli2蛋白Sumo化修饰作用机制的研究[目的]探究Sumo化修饰对Gli2转录活性抑制的分子作用机制,研究野生型Gli2、突变型Gli2与组蛋白脱乙酰酶(HDACs)之间的相互作用。[方法]将野生型Gli2基因和两个Sumo化位点突变的变异型Gli2基因Gli2K630/716R与flag标记的HDAC4基因和HDAC5基因分别在HEK293细胞中表达,将细胞裂解提取蛋白,各取少量细胞蛋白分别用Flag抗体和Gli2抗体行免疫印迹实验,剩余大部分细胞蛋白用Gli2抗体行免疫沉淀作用,然后用Flag抗体行免疫印迹实验,测定各类基因的蛋白表达量。[结果]1、HDAC4蛋白表达水平比HDAC5表达水平要低。2、免疫共沉淀实验表明,Gli2抗体可以沉淀残余的HDAC5,即便Gli2蛋白没有过表达。当Gli2与HDAC5共表达的时候,HDAC5被沉淀的蛋白量明显增高。3、当HDAC5与Gli2K630/716R共表达的时候,HDAC5被沉淀的蛋白量与其单独表达时候的蛋白量相近。4、当HDAC4与Gli2或Gli2K630/716R共表达时,HDAC4被沉淀的蛋白量相似。[讨论]与HDAC4相比,Gli2优先与HDAC5相结合。只有Gli2能与HDAC5结合,而Gli2K630/716R不能与HDAC5相结合。我们的结论是Sumo化修饰抑制Gli2转录活性,很大的可能性是通过招募HDAC类蛋白。