β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC3.2.1.23)属于糖苷水解酶类,可以催化乳糖或显色底物(2-硝基苯-β-D-半乳糖苷, 5-溴-4-氯-3吲哚基-D-半乳糖苷)中β-1,4-半乳糖苷键。β-半乳糖苷酶被广泛应用于食品工业及分子生物学领域,并主要用于食品工业中低乳糖奶的生产,通过将乳糖降解为葡萄糖和半乳糖可以有效缓解乳糖不耐受问题。嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶(BgaB)具有良好的稳定性、中性最适作用pH及适宜的作用温度。相对目前普遍采用的商业化中温β-半乳糖苷酶的水解反应,耐热β-半乳糖苷酶高温水解特性具有防止微生物污染、提高底物溶解性及降低底物抑制作用等优点,因而具有工业应用潜力。在前期研究中发现,BgaB对乳糖水解活性较低。本项课题的研究目的为通过现代分子生物学技术对嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶BgaB进行功能改造以提高其水解效率。同时,由于BgaB所属GH-42家族嗜极性微生物来源β-半乳糖苷酶普遍存在不善于利用乳糖作为底物的特点。因此,本课题对BgaB的分子改造对该家族酶的研究也具有借鉴意义。课题通过分子模拟对BgaB酶结构进行建模。并分别从BgaB的底物抑制作用、水解活性及酶的热稳定性三个方面对其水解效率进行改造及突变体酶学性质研究,探讨不同氨基酸位点突变对酶结构和功能的影响。概括本项研究主要结果如下:(1) BgaB分子结构模拟分析显示β-半乳糖苷酶具有典型的TIM (Distored triosephosphate isomerase)桶状结构,由8个重复的β-折叠接α-螺旋的“(β/α)8”单元构成酶的催化结构域。催化中心Glu148和Glu303,分别位于TIM桶状结构的第4和第7个β片层结构上。底物抑制剂对接及分子动力学模拟获知参与酶抑制剂结合的氨基酸位点包括Arg109, Phe341, Trp311, Asn147, Asn310, Try272和His354。通过分子动力学模拟及体外Ala替换突变对各抑制剂结合位点作用研究结果表明,Phe341位点对水解产物半乳糖的抑制作用有显著影响。通过对Phe341位点改造得到F341T突变体底物抑制作用最低,Ki值为220mM。(2)为了提高BgaB的水解活性,我们运用半理性设计方法针对分子结构模拟预测得到的各底物结合位点构建饱和突变体库。并通过筛选获得了水解活力提高的突变体R109V ,R109W ,Y272S, Y272A和E351R。其中,E351R突变体比酶活为野生型酶的3.5倍。Arg109位点饱和突变体库筛选结果发现Arg109位点突变后有致酶失活现象。对Arg109位点饱和突变获得两个失活突变体分别Arg109位点被非极性氨基酸Ala及Gly所替换。本研究工作证明Arg109位点是维持BgaB具有催化活性的必需氨基酸位点。(3)由于耐热β-半乳糖苷酶在原核表达体系中稳定性降低,影响了酶的催化功能。为了提高其稳定性,改善催化效率,我们针对BgaB在非活性区域内相对同家族耐热酶的差异位点进行突变改造。研究表明Ile42位点对热稳定性具有影响作用,且该位点被Glu替换后提高了酶的热稳定性。I42E突变体酶相对于野生型酶可以将70℃的半衰期由10min提高至40min。结构分析表明,Ile42位点位于TIM桶状结构边缘,突变为Glu后可与保守氨基酸残基Ser39形成氢键。Ile42和Ser39同被Ala替换突变后导致酶的活性及热稳定性下降。Ile42、Ser39单点及双点Ala替换均使突变体Tm值相对野生型降低。研究结果显示Ile42位点与Ser39位点间氢键的形成对酶的热稳定性有重要作用。本项研究同时表明耐热酶在进化过程中可能采取了损失部分稳定性以提高催化活性的策略。(4)将底物抑制作用降低的突变体、活性提高突变体以及热稳定性提高突变体之间进行累积突变研究。研究结果表明通过双点突变分别获得了水解活性与稳定性、底物抑制作用与稳定性同时提高的突变体。本研究工作证明,热稳定性与酶活性可以同时获得功能改善。但底物结合位点之间相互协同作用趋向产生负向结果,并导致酶学性质的改变。