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研究背景和目的:视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma,RB）是一种原发性眼内恶性肿瘤,多发于儿童。近年来,随着外科手术和各种化疗方法的发展,视网膜母细胞瘤患者的生存率有所提高。然而,由于视网膜母细胞瘤对化疗的敏感性有限,其死亡率仍然很高。因此,了解视网膜母细胞瘤化疗耐药的分子事件并制定分子靶向治疗策略对于治疗这种恶性疾病非常重要。长链非编码RNA（lnc RNAs）是一组无明显蛋白质编码功能的非编码RNA亚群,其长度超过200个核苷酸。lnc RNAs参与多水平基因表达调控,包括通过招募染色质修饰的复合物进行转录调控,以及通过与蛋白质、m RNA或mi RNA相互作用进行转录后调节。新证据表明,lnc RNAs调控癌症的许多特征,包括化疗耐药性、凋亡和增殖。lnc RNA UCA1位于染色体19p13.12上,最早在膀胱癌中发现,它通过调节细胞的增殖、迁移、凋亡以及侵袭来促进各种肿瘤的进展。更重要的是,除了致癌功能外,lnc RNA UCA1还调节各种癌症的耐药性。例如,lnc RNA UCA1促进细胞增殖,并导致结肠癌患者对5-氟尿嘧啶产生耐药性。lnc RNA UCA1表达降低可增加顺铂诱导的人口腔鳞状细胞癌细胞的化疗敏感性。然而,lnc RNA UCA1在视网膜母细胞瘤卡铂耐药中的作用尚不清楚。另外,研究证实AXL和c-Met在肿瘤细胞卡铂耐药过程中起关键作用。因此,在本论文中,我们研究了lnc RNA UCA1对视网膜母细胞瘤卡铂耐药的影响,同时,探讨了在卡铂耐药的视网膜母细胞瘤中lnc RNA UCA1是否可以调控AXL和c-Met的表达并探索其中潜在的机制。方法:1、利用视网膜母细胞瘤细胞株WERI-RB-1和Y79构建皮下荷瘤模型,然后利用卡铂处理构建卡铂耐药的视网膜母细胞瘤细胞WCR3rd和YCR3rd,并通过q RT-PCR检测lnc RNA UCA1在视网膜母细胞瘤细胞株WERI-RB-1、Y79和卡铂耐药的视网膜母细胞瘤细胞WCR3rd、YCR3rd的表达情况;2、利用干扰技术、软琼脂克隆、流式细胞分析等实验观察改变卡铂耐药的视网膜母细胞瘤细胞WCR3rd和YCR3rd中lnc RNA UCA1的表达后,细胞对卡铂敏感性的变化;通过皮下裸鼠荷瘤模型观察改变卡铂耐药的视网膜母细胞瘤中lnc RNA UCA1表达后,卡铂耐药视网膜母细胞瘤对卡铂敏感性的影响;3、利用干扰技术、Western blot、q RT-PCR观察改变卡铂耐药的视网膜母细胞瘤细胞中lnc RNA UCA1后AXL和c-Met的表达情况,并利用软琼脂克隆、流式细胞分析等实验明确lnc RNA UCA1是否通过调控AXL和c-Met的表达进而影响卡铂耐药视网膜母细胞瘤对卡铂的敏感性。4、通过FISH实验检测lnc RNA UCA1在视网膜母细胞瘤细胞中的分布情况,通过RNA免疫共沉淀实验（RIP）和荧光素酶报告等实验,以明确lnc RNA UCA1和mi R-206之间的相互关系。检测lnc RNA UCA1和mi R-206之间的关系,并明确了lnc RNA UCA1是否通过mi R-206调控AXL和c-Met的表达进而影响卡铂耐药视网膜母细胞瘤对卡铂的敏感性。结果:1、与亲本细胞相比,第三代视网膜母细胞瘤细胞YCR3rd和WCR3rd对卡铂的敏感性显著的下降,其经卡铂处理后,凋亡减少,生长能力增强。为了鉴定卡铂耐药视网膜母细胞瘤细胞lnc RNA的表达情况,通过RNAseq芯片结果发现,与亲本细胞相比,第三代视网膜母细胞YCR3rd和WCR3rd中lnc RNA UCA1表达显著增加。2、通过慢病毒介导的短发夹RNA（sh RNA）降低第三代视网膜母细胞瘤细胞YCR3rd和WCR3rd中lnc RNA UCA1的表达后,体外实验和体内实验结果发现降低lnc RNA UCA1可以显著的增加耐药视网膜母细胞瘤细胞对卡铂的敏感性。3、在第三代视网膜母细胞瘤细胞YCR3rd和WCR3rd中降低lnc RNA UCA1的表达后,通过Western blot检测发现AXL和c-Met的表达显著的下降。进一步确定了AXL和c-Met是否在功能上参与了lnc RNA UCA1介导的卡铂耐药,“回复”实验发现过表达AXL和c-Met能阻断由降低lnc RNA UCA1导致的卡铂的敏感性增加。此外,AXL和c-Met的小分子抑制剂BMS777607能使lnc RNA UCA1过表达细胞对卡铂重新敏感。这些结果说明AXL和c-Met是UCA1介导视网膜母细胞瘤细胞对卡铂耐药的关键因素。4、分析lnc RNA UCA1在视网膜母细胞瘤细胞中的分布情况,发现在Y79细胞中,lnc RNA UCA1既存在于胞浆中,也存在于细胞核中,但lnc RNA UCA1在胞浆中所占比例高于细胞核。此外,我们使用Sta RBase V2.0寻找到lnc RNA UCA1互补碱基对的mi RNAs。生物信息学分析显示,lnc RNA UCA1可能吸附mi R-206从而调控AXL和C-Met的表达。通过荧光素酶报告基因等实验我们证实转染mi R-206模拟物显著抑制了PGL3-UCA1/WT的荧光素酶活性,PGL3-UCA1/MUT对mi R-206模拟物没有反应。这些结果表明,lnc RNA UCA1包含功能性的mi R-206结合位点。此外,用mi R-206抑制剂抑制mi R-206,能阻断下调lnc RNA UCA1引起的视网膜母细胞瘤对卡铂敏感性的增加。相反,引入mi R-206模拟物消除了增加lnc RNA UCA1介导的卡铂耐药。进一步研究lnc RNA UCA1介导的mi R-206分离是否与AXL和c-Met的上调有关。结果发现lnc RNA UCA1敲除后,AXL和c-Met报告基因的荧光素酶活性降低,而mut报告基因的荧光素酶活性保持不变。相比之下,过表达lnc RNA UCA1后,AXL和c-Met野生型报告细胞的荧光素酶活性呈剂量依赖性增加,而mi R-206过表达消除了这种影响。这些数据表明lnc RNA UCA1作为mi R-206的分子海绵,促进了AXL和c-Met的表达。结论:综上所述,lnc RNA UCA1在卡铂耐药的视网膜母细胞瘤中表达显著的增加,进一步通过体内和体外实验证实lnc RNA UCA1通过促进AXL和c-Met的表达进而导致视网膜母细胞瘤细胞对卡铂耐药。机制研究证实lnc RNA UCA1通过mi RNA-206调控AXL和c-Met的表达导致视网膜母细胞瘤细胞对卡铂耐药,且lnc RNA UCA1作为mi R-206的ce RNA,进而调控mi R-206靶基因AXL和c-Met的表达。