肿瘤多药耐药(Multidrug resistance,MDR)是肿瘤细胞对药物产生了耐药性所致,MDR产生的机制有多种:抑制药物诱导的细胞凋亡,激活DNA损伤修复机制,增加外排泵识别功能,并快速有效地从癌细胞中泵出化学治疗剂。目前,克服MDR的策略之一是使用基于纳米医学技术的药物传递系统。由于该递药系统是纳米级尺寸,主要通过内吞作用进入细胞,从而有效绕过负责MDR的药物外排泵的作用,同时可以在其表面进行不同的修饰,增强抗肿瘤效果。迄今为止,研究者已经开发了多种纳米材料作为治疗剂用于逆转肿瘤MDR,如胶束、脂质体、和树枝状大分子等。本研究将脂溶性的声敏剂二氢卟吩(Chlorin e6,Ce6)与表面活性剂材料普朗尼克F127(Pluronic F-127,PF127)通过共价连接,合成具有声敏活性的聚合物PF127-Ce6(PFC),之后将化疗药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)包载在 PF127-Ce6与普朗尼克P123(Pluronic P-123,P123)所形成的聚合物核心中,最终制备了声敏剂Ce6与DOX共载的纳米混合胶束(PFC@DOX)。本研究通过对该纳米制剂的形貌、稳定性、光谱特性等物理属性进行表征,探究所制备的PFC@DOX纳米混合胶束通过声-化疗联合作用,体内外抑制肿瘤组织/细胞生长及逆转肿瘤耐药的可能机制,为克服肿瘤MDR提供相关研究新思路。主要研究内容(1)PFC@DOX纳米制剂的制备与表征本研究在DMSO中将PF127与Ce6进行共价连接,通过红外光谱、核磁共振氢谱对PF127与Ce6的连接情况进行检测,并对PF127-Ce6的光谱性质进行分析,证实所合成的声敏聚合物PF127-Ce6没有改变Ce6的光学性质,连接率为94.45%。通过PF127-Ce6与P123的自组装作用将DOX负载在聚合物核心中,对制备的PFC@DOX纳米混合胶束进行形貌观察、粒径、电位和稳定性检测,结果显示本研究所采用的O/W单乳法成功制备出粒径为82.82±4.62 nm、分散系数为0.131 ±0.021的载药纳米复合物。进一步对纳米混合胶束药学性质和稳定性进行分析,结果表明DOX被成功包载在了纳米核心中,载药量为6.57%,在超声作用下,DOX可从聚合物胶束中被突释出来。(2)PF127-Ce6(PFC)纳米制剂的声动力(Sonodynamic therapy,SDT)效应研究研究通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜对细胞内ROS含量进行测定,结果显示PFC纳米混合胶束在超声作用下可以产生大量ROS,提示PFC-SDT抗肿瘤作用可能与ROS产生有关。进一步对线粒体膜电位变化、细胞呼吸链上的NADH总量、细胞氧化磷酸化水平、胞内ATP含量进行分析,结果发现MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞经PFC+US处理后,线粒体膜电位发生了改变,NADH含量降低,细胞氧化磷酸化水平降低,胞内ATP水平减少至正常水平的49%。(3)超声联合PFC@DOX纳米制剂对肿瘤细胞的杀伤效应研究通过MTT法对PFC@DOX纳米制剂在超声(Ultrasound,US)作用下对肿瘤细胞的杀伤效应进行分析,结果表明纳米混合胶束通过声-化疗协同作用,可以有效杀伤MCF-7和MCF-7/ADR细胞,并且随着药物浓度的增加,对细胞的杀伤效果亦增强。对于MCF-7/ADR来说,当PFC@DOX联合超声后,细胞存活率下降至30.94%,说明PFC@DOX+US可通过声-化疗联合处理一定程度上逆转肿瘤耐药,单独 DOX 和胶束中 DOX 的 IC50 值分别为 48.6±0.14μg/mL 和 5.5±0.14μg/mL。通过流式细胞仪结合Annexin V/PI检测肿瘤细胞凋亡发现,细胞经PFC@DOX+US处理后,MCF-7/ADR和MCF-7细胞的凋亡率分别增加至57.36%和87.84%。(4)超声联合PFC@DOX纳米制剂逆转乳腺癌耐药机制分析通过荧光显微对DOX在肿瘤细胞中的富集情况进行分析,结果显示PFC@DOX+US在两种肿瘤细胞中都可以大量富集,然而,对MCF-7/ADR肿瘤细胞来说,游离的DOX基本上不能有效进入肿瘤细胞,当PFC@DOX+US处理耐药细胞后,DOX在细胞中的荧光强度显著增强。通过对MCF-7/ADR的细胞周期进行检测,与Control组相比,PFC@DOX+US组的细胞主要被滞留在G2/M期。同时Western blot实验对耐药细胞的P-gp、p-H2A.X蛋白表达情况进行检测,结果证实ATP依赖性药物外排泵P-gp在PFC@DOX+US组中表达量明显降低。当MCF-7/ADR与PFC@DOX共孵育并暴露于超声作用下时,DNA双链断裂的标记蛋白p-H2A.X磷酸化水平显著上升。(5)体内水平研究超声联合PFC@DOX对MCF-7/ADR生长抑制情况建立荷MCF-7/ADR裸鼠皮下移植瘤模型,探究PFC@DOX纳米制剂在超声作用下对耐药肿瘤组织生长抑制情况。结果显示,超声联合PFC@DOX对MCF-7/ADR肿瘤抑制率高达85.49%。肿瘤组织H&E染色结果提示PFC@DOX+US通过声-化疗协同作用高效杀伤耐药性肿瘤细胞。通过对小鼠体重进行实时测量和小鼠血清中谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)和尿素氮(BUN)含量测定及对各组小鼠主要脏器的形态学观察,说明PFC@DOX纳米制剂联合超声的治疗策略具有较高的生物安全性。结论综上所述,本研究成功制备出具有声化疗协同抗肿瘤效应的新型纳米制剂PFC@DOX。该纳米制剂具有粒径适中、结构均一、稳定性良好等特点,超声作用下,可以实现药物的声控释放。体内、外实验均证实PFC@DOX+US对肿瘤组织/细胞均显示协同杀伤效应。通过对PFC@DOX+US逆转肿瘤MDR机制进行探究,结果提示PFC@DOX在超声作用下,促使ATP水平下降和P-gp表达降低,进而增加DOX在MCF-7/ADR细胞内的蓄积,增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效应。