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马立克病(Marek’s disease,MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)早期感染雏鸡引发的一种重要的免疫抑制病及肿瘤病。近年来由于MDV毒力的持续增强,MD疫情在全球范围内仍不断暴发。该病是第一个可用病毒疫苗成功预防的肿瘤病,为深入研究疱疹病毒致瘤的生物学、遗传学及免疫学提供了极好的动物模型。MicroRNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA,在许多生物学过程中发挥重要的基因调控功能。MDV-1编码的26个成熟miRNA来自于14个miRNA前体,在基因组中形成3个明显的miRNA基因簇,分别命名为Meq基因簇、LAT基因簇和Mid基因簇,其中Meq基因簇和Mid基因簇的转录和表达受同一个启动子调控。多项研究发现,Meq基因簇miRNA在调控MDV-1致瘤过程中发挥关键作用,而位于其下游的Mid基因簇miRNA的潜在调控功能尚不清楚。因此,本研究利用细菌人工染色体(BAC)技术和Rec E/T同源重组技术,构建Mid基因簇中的miRNA单基因和基因簇缺失MDV-1毒株,通过动物实验分析Mid基因簇内编码的病毒miRNA与MDV-1致病性的关系,筛选并鉴定该基因簇中潜在调控MDV-1致病或致瘤表型的病毒miRNA,为进一步阐明它们的分子调控机制奠定重要基础。首先,利用MDV-1 GX0101-BAC质粒为亲本载体,利用Rec E/T系统进行Mid基因簇miRNAs基因同源重组敲除,构建miR-M1、miR-M11和miR-M31单基因及整个Mid基因簇缺失的候选BAC克隆,并对其进行PCR扩增鉴定、DNA测序以及限制性片段长度多态性(RFLP)分析。结果表明,经过2轮Rec E/T同源重组,成功获得了3个miRNA前体基因缺失和Mid基因簇缺失的BAC克隆质粒,分别命名为GXΔmiR-M1-BAC、GXΔmiR-M11-BAC、GXΔmiR-M31-BAC和GXΔMid-mi Rs-BAC。然后,将4个BAC重组质粒分别转染CEF细胞,进行病毒miRNA基因缺失感染性BAC克隆的拯救,并同上对拯救毒株的基因组DNA进行PCR扩增和DNA测序鉴定。同时提取各miRNA基因缺失毒株感染CEF细胞的总RNA,利用q RT-PCR分别进行相应miRNA的表达以及相关基因的表达鉴定。提取GX0101亲本毒株和各miRNA基因缺失毒株感染CEF细胞后不同时间细胞毒总DNA,利用qPCR对相应DNA的meq和gB基因进行定量检测,测定病毒增殖曲线。结果表明:成功拯救获得4个Mid基因簇miRNAs的单基因或基因簇的双等位基因缺失毒株,分别命名为GXΔmi R-M1、GXΔmiR-M11、GXΔmiR-M31和GXΔMid-mi Rs;在各miRNA基因缺失毒株中,相邻miRNA的表达并未受到影响,且相邻基因meq、RLORF6、RLORF5a和RLORF4的表达也与预期相符;各miRNA基因缺失毒株与GX0101亲本毒株具有相似的体外病毒增殖曲线。最后,用GX0101亲本毒株、GXΔmi R-M1、GXΔmi R-M11、GXΔmiR-M31和GXΔMid-mi Rs基因缺失毒株分别感染1日龄SPF鸡,以等剂量CEF正常细胞为阴性对照,对各毒株的体内复制能力(病毒血症)、感染鸡生长性能(体重)、免疫器官指数(胸腺/体重、法氏囊/体重指数)、致死率及致瘤率等进行分析。结果表明:与GX0101亲本毒株相比,各miRNA基因缺失毒株在感染鸡体内复制曲线稍有不同;从14 dpi开始,各组感染鸡体重均显著或不同程度低于CEF细胞阴性对照组,14~30 dpi各组感染鸡的囊重比指数和胸腺重比指数显著低于CEF细胞阴性对照组;14 dpi以后除CEF细胞对照组鸡未发生死亡外,各攻毒组鸡群均发生不同程度的鸡只死亡,其中GXΔMid-miRs感染组至75 dpi时全部死亡,死亡率为100%,肉眼肿瘤率为21.0%;至90 dpi实验周期结束时,GXΔmi R-M1、GXΔmiR-M11和GXΔmiR-M31感染组的死亡率分别为83.3%、71.8%和69.2%,肉眼肿瘤率分别为31.7%、45.0%和31.7%;而亲本毒GX0101感染组的死亡率和肿瘤发生率分别为79.4%和40.0%。上述研究结果表明,Mid基因簇编码的miRNAs是MDV-1复制的非必须基因,与病毒感染导致的免疫抑制关系不大,但这些miRNAs的基因缺失不同程度的改变了MDV-1的致死率或致瘤率。与GX0101亲本毒株相比,整个Mid基因簇的缺失显著增强了MDV-1的致死率;miR-M1的单基因缺失增强了MDV-1的致死率,miR-M11的单基因缺失则增强了MDV-1的致瘤率,而miR-M31的基因缺失则同时降低了MDV-1的致死率和致瘤率。这些结果提示,Mid基因簇编码的miRNAs在MDV-1致病和致瘤过程中可能扮演原癌基因或抑癌基因不同角色,为今后深入研究这些病毒miRNA的分子调控机制提供了重要线索。