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植物内生菌(Endophyte)是指一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织和器官内部的真菌或细菌。内生菌普遍存在于高等植物中,在植物体内能够稳定生存,不易受外界环境的影响,并可在植物体内进行独立的繁殖,与宿主植物进行长期的协同进化。植物内生菌可增强植物抗逆性,对宿主植物有促生作用,有的还有固氮作用,有的能够作为外源基因载体,参与生物修复等。近年来,人们重视利用植物内生菌制作微生物农药进行生物防治,制作菌肥提高作物产量。苔藓植物的内生菌也有零星报道,但是与种类繁多和生境多样性的苔藓植物而言,苔藓植物的内生菌研究不够。羽枝青藓(Brachythecium plumosum)、疣灯藓(Trachycystis microphylla)、鳞叶藓(Taxiphyllum taxirameum)和凤尾藓(Fissidnes bryoides)是我国东部地区的常见藓类植物,其中羽枝青藓具有较高的园艺景观价值。本论文以羽枝青藓为材料,通过实验掌握藓类植物内生菌分离和检测所需要的最佳表面灭菌方式;开展了羽枝青藓可培养内生菌中具有促生和抑菌功能性的内生菌种源筛选实验;通过高通量测序法初步了解不同生境条件对羽枝青藓内生菌群落构成和多样性的影响;以及内生菌在鳞叶藓、疣灯藓和凤尾藓三种藓类中的差异情况,从而初步了解藓类植物内生菌的基本情况,以及对宿主是否具有选择性。主要的研究结果如下:(1)以羽枝青藓为材料,实验比较了紫外线照射、75%浓度乙醇溶液、过氧化氢溶液、升汞溶液、次氯酸钠溶液以及两两不同组合搭配对于羽枝青藓植物表面灭菌效果,发现30s乙醇+9 min H2O2(30%过氧化氢)这种灭菌方案适合于藓类植物内生菌分离、检测的藓类植物配子体表面消毒方式,既可以保证藓类植物表面灭菌彻底,同时保留藓类植物活力。(2)将羽枝青藓配子体研磨后涂布于培养基平板,获得了丰富的内生菌种类;将内生菌进一步分离纯化之后摇制成菌液,通过具有针对性的功能性实验筛选出了具有促进羽枝青藓生长或者抑制羽枝青藓上病菌传播的内生菌种类。发现苏云金杆菌konkukian变种(Bacillus thuringiensis serovar konkukian str.97-27)对羽枝青藓生长具有促进作用,短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)对羽藓青藓病菌具有一定的抑菌作用。(3)运用高通量测序法比较了人工种植环境、城市环境和天目山野生环境下羽枝青藓内生菌多样性和功能性特点,发现羽枝青藓在三种不同环境下内生菌OTU数没有明显差异,主要的内生菌有变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)等,以及假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、丛毛单胞菌(Comamonadaceae)、小单孢菌(Micromonospra)以及草酸杆菌(Oxalobacteraceae)等分类群。基于内生菌丰度,发现三种环境的羽枝青藓内生菌群落虽然也可以分组,但是分组与来源环境没有对应性,反映出环境条件对羽枝青藓内生菌组成没有明显影响,不过天目山野生环境下的内生菌功能性较多,而城市环境下的内生菌功能性较弱。(4)通过高通量测序法检测了相同环境下鳞叶藓、疣灯藓、凤尾藓的内生菌,发现三种苔藓分别分离出了2524、3092、2281个OTU,而三者共有的OTU数仅731个;三种藓类植物主要的内生菌隶属于变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)以及拟杆菌门(Bacteroidetes)和黄杆菌(Flarobacterium)、丛毛单胞菌(Comamonadaceae)等属,三者共有菌的种类主要有Cyanobacteria(门)、Betaproteobacteria(纲)、Flavobacteriales(目)、Deltaproteobacteria(纲)、放线菌Actinobacteria、Gammaproteobacteria(纲)、浮霉菌Planctomycetacia(纲)和乳球菌属Lactococcus的种类。鳞叶藓、疣灯藓和凤尾藓内生菌的主要区别在于分支杆菌(Mycobacterium)、小单孢菌(micromonospora)、游动放线菌(actinoplanes)、芽孢杆菌(bacillus)、生丝微菌属(hyphomicrobium)等内生菌在鳞叶藓中有较高的丰度,土微菌属(pedomicrobium)、小梨形菌属(pirellula)、丛毛单胞菌属(comamonas)等内生菌在疣灯藓中丰度较高,而气单胞菌属(aureimonas)、螺状菌属(spirosoma)等内生菌在凤尾藓中有相对较高的丰度。检测到的主要代谢功能有外源性物质降解和代谢、核苷酸代谢、萜类化合物和多酮类化合物代谢、氨基酸代谢、维生素代谢、脂质代谢、多糖生物合成代谢、酶家族、能量代谢、碳水化合物代谢、其他次生代谢物的生物合成和氨基酸代谢产物。其中鳞叶藓的内生菌具有较强的外源性物质降解和代谢功能、能量代谢功能、碳水化合物代谢功能以及其他次生代谢物的生物合成功能,凤尾藓和疣灯藓分离出的内生菌主要具有能量代谢功能。因此,三种藓类的内生菌多样性及其功能性有较明显的差异,反映藓类植物内生菌对宿主植物具有一定的选择性。研究还发现了一些重要的内生菌功能。例如四种藓类内生菌植物内生菌中,与抗菌素运输系统ATP结合蛋白有关的代谢活性较高,一定程度上解释了藓类植物自身具有抗病菌的生物学基础。