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目的Wiskott-aldrich 综合征(wiskott-aldrich syndrome,WAS)是一种 X 连锁免疫缺陷综合征,主要临床表现为血小板数目降低,同时还并发湿疹、反复感染和免疫功能低下等症状,Wiskott-aldrich 综合征蛋白(wiskott-aldrich syndrome protein,WASP)中的许多基因突变可引起WAS。其中,神经来源的Wiskott-aldrich综合征蛋白(neuronal wiskott-aldrich syndrome protein,N-WASP)是 WASP 家族中参与肌动蛋白细胞骨架重组的重要组成部分。N-WASP在WASP家族蛋白中广泛表达,在促进细胞迁移,受体信号传导和免疫炎症反应中起着至关重要的作用。已有研究表明在小鼠体内敲除N-WASP可导致小鼠出现免疫缺陷和慢性皮肤炎,主要为牛皮癣样改变。牛皮癣是一种常见的慢性炎症性多系统疾病,主要的病损多表现在皮肤和关节中,其病因非常复杂,主要与T淋巴细胞介导的免疫力的改变有关。研究表明慢性牙周炎发病也与T淋巴细胞介导的免疫功能改变有关。慢性牙周炎也是一种慢性炎症性疾病,其特征是破坏牙齿的支持组织,最终导致牙槽骨吸收和牙齿脱落。牙周炎的发生是由在牙齿上形成的复杂多样的菌斑生物膜引起的。慢性牙周炎和牛皮癣都是慢性炎性疾病,已有研究表明二者有相似的发病机制,但N-WASP在慢性牙周炎发病机理中的作用尚不清楚。因此,本研究旨在评估N-WASP敲低后对人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)中炎症因子表达的影响以及其潜在作用机制。实验方法体内实验:选用7周龄小鼠,分为利用Crisper-Cas9技术敲除N-WASP的实验组和未处理的正常对照组,处死后取小鼠的牙龈组织,通过苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H&E)评估实验组和对照组小鼠的牙龈炎症状况。体外实验:选用健康人牙龈组织,通过酶消法获得人牙龈成纤维细胞,传代至第3-5代,分为阴性对照组(negative control,NC)组和siRNA敲低N-WASP组(si组),通过小干扰 siRNA(small interfering RNA)技术敲低 HGFs 中的 N-WASP,并通过实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)筛选以获得最佳敲低序列。随后通过qRT-PCR检测敲低N-WASP后HGFs 中白介素(interleukin,IL)-6、IL-8、C-C 基序配体 2(C-C motif ligand 2,CCL2)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)和前列腺素内过氧化物合酶 2(prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2)的表达量在基因水平的改变;通过酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测IL-6、IL-8和SOD2的表达量在蛋白水平的改变;继而通过蛋白质免疫印迹(western blot,WB)检测敲低 N-WASP 后相关通路核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路是否被激活。为了进一步证实N-WASP敲除后MAPK和NF-κB通路的激活情况,分别加入10μM c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路抑制剂(SP60012)、10μM 细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路抑制剂(U0126)、10μM p38 通路抑制剂(SB203580)和5μM p65通路抑制剂(BAY11-7082),通过qRT-PCR验证加入通路抑制剂后炎症因子表达量在基因水平的改变。结果1、体内实验结果表明,N-WASP基因敲除小鼠的牙龈组织表现出炎症反应:牙龈组织有明显的淋巴细胞浸润,上皮棘突伸长,腺泡形态丧失和腺泡被淋巴细胞取代。2、N-WASP敲低可上调HGFs中的炎症因子的表达:利用siRNA技术敲低HGFs中的N-WASP后继续分别培养6、24和48h,qRT-PCR结果表明,敲低组的SOD2(P<0.01)、IL-6(P<0.001)、IL-8(P<0.001)、CCL2(P<0.001)和PTGS2(P<0.001)在基因水平表达显著升高。ELISA结果显示,敲低组的IL-6(P<0.01)、IL-8(P<0.001)和CCL2(P<0.001)在蛋白水平的分泌量上调。3、N-WASP敲低通过NF-κB和MAPK信号通路调节炎症因子的表达:WB结果显示,N-WASP敲低显著促进了NF-κB p65的表达,同时,p38、JNK和ERK信号通路的磷酸化水平升高。加入上述通路的抑制剂后,qRT-PCR检测结果表明,N-WASP敲低增强了IL-6、IL-8、CCL2、PTGS2和SOD2在mRNA水平的表达(P<0.001)。但是,加入SP60012、U0126、SB203580和BAY11-7082后明显抑制了敲低N-WASP后HGFs中的IL-6、IL-8、CCL2、PTGS2和SOD2表达的上调(P<0.001)。结论1、本研究有限的研究结果表明,N-WASP可能在牙周炎发病过程中发挥一定作用,其作用机制为N-WASP敲低促进HGFs中炎症因子的表达。2、N-WASP敲低通过NF-κB和MAPK信号通路上调HGFs中炎症因子的表达。