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背景:氧化应激损伤是脑缺血后的核心病理环节之一,而小胶质细胞的异常活化与氧化应激密切相关。小胶质细胞活化过程是M1(促炎性)和M2(抗炎性)型小胶质细胞的极化过程。已有研究证明白藜芦醇具有抗氧化应激和促进小胶质细胞向M2型转化的作用,然而机制尚未阐明。已有研究显示白藜芦醇能分别激活Nrf2和Shh信号通路,从而发挥神经保护或修复作用。那么,Nrf2和Shh信号是否参与小胶质细胞M2型极化过程,且二者之间是否相互作用,尚待研究。因此,本研究采用离体方式探讨Nrf2和Shh信号相互作用以及在白藜芦醇调控OGD/R损伤后小胶质细胞极化及氧化应激损伤中的作用,为白藜芦醇早日用于临床以及开发设计新药提供坚实的实验基础。方法:体外培养的N9小胶质细胞系行氧糖剥/再复氧模型(OGD/R);N9小胶质细胞-HT22神经元条件共培养模型。1.探讨Nrf2信号在白藜芦醇调控OGD/R损伤后小胶质细胞极化及氧化应激损伤中的作用及对Shh信号通路的影响。实验分为6组:(1)正常组(Nor),(2)对照组(Ctrl),(3)20umol/L白藜芦醇组(Res),(4)Nrf2抑制剂5μmmol/L ML385组(ML385),(5)20umol/L白藜芦醇+5μmmol/L ML385组(R+M),(6)Nrf2激动剂100nmmol/LRTA-408组(RTA-408)。2.探讨Shh信号在白藜芦醇调控OGD/R损伤后小胶质细胞极化及氧化应激损伤中的作用及对Nrf2信号通路的影响。实验分为5组:(1)正常组(Nor),(2)对照组(Ctrl),(3)20umol/L白藜芦醇组(Res),(4)Shh信号通路Smo受体抑制剂5umol/L环王巴明组(cyclopamine,Cyc),(5)20umol/L白藜芦醇+5umol/L环王巴明组(R+C)。3.探讨神经元-小胶质细胞条件共培养对HT22神经元的影响。3.1探讨Nrf2信号介导白藜芦醇对神经元-小胶质细胞条件共培养对神经元的影响。实验分为6组:(1)正常组(Nor),(2)对照组(Ctrl),(3)20umol/L白藜芦醇组(Res),(4)Nrf2抑制剂5μmmol/LML385组(ML385),(5)20umol/L白藜芦醇+5μmmol/L ML385组(R+M),(6)Nrf2激动剂100nmmol/LRTA-408组(RTA-408)。3.2探讨Shh信号介导白藜芦醇对神经元-小胶质细胞条件共培养对神经元的影响。实验分为5组:(1)正常组(Nor),(2)对照组(Ctrl),(3)20umol/L白藜芦醇组(Res),(4)Shh信号通路Smo受体抑制剂5umol/L环王巴明组(cyclopamine,Cyc),(5)20umol/L白藜芦醇+5umol/L环王巴明组(R+C)。采用CCK-8法、TBA法和WST-1法分别测定细胞活力、MDA含量和SOD活力。免疫荧光法、Western blotting和RT-qPCR法检测N9小胶质细胞的M1型标志物iNOS和TNF-α、M2型标志物CD206和Arg1、Shh和Nrf2信号通路相关蛋白或mRNA的表达。流式细胞学检测HT22神经元的凋亡。结果:1.Nrf2信号在白藜芦醇调控OGD/R损伤后小胶质细胞极化及氧化应激损伤中的作用及对Shh信号通路的影响。OGD/R损伤后,与对照组相比:白藜芦醇组和Nrf2激动剂RTA-408组细胞活力、SOD活力、CD206、Arg1、Shh、Ptc-1、Smo、Gli1相关蛋白或mRNA表达均显著升高,而MDA含量和iNOS、TNF-α蛋白或mRNA表达均显著降低(P<0.05),白藜芦醇组Shh蛋白明显较对照组移位到细胞核。Nrf2抑制剂ML385组细胞活力、SOD活力、CD206、Arg1、Shh、Ptc-1、Smo、Gli1相关蛋白或mRNA表达均明显降低,而MDA含量和iNOS、TNF-α蛋白或mRNA表达均明显升高(P<0.05),ML385组Shh蛋白主要表达在细胞浆中。2.Shh信号在白藜芦醇调控OGD/R损伤后小胶质细胞极化及氧化应激损伤中的作用及对Nrf2信号通路的影响。OGD/R损伤后,与对照组相比:白藜芦醇组细胞活力、SOD活力、CD206、Arg1、Nrf2、HO-1、NQO1相关蛋白或mRNA表达均显著升高,而MDA含量和iNOS、TNF-α蛋白或mRNA表达均显著降低(P<0.05),白藜芦醇组Nrf2蛋白明显较对照组移位到细胞核。环王巴明组细胞活力、SOD活力、CD206、Arg1、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白或mRNA表达均明显降低,而MDA含量和iNOS、TNF-α蛋白或mRNA表达均明显升高(P<0.05),环王巴明组Nrf2蛋白主要表达在细胞浆中。3.神经元-小胶质细胞条件共培养对HT22神经元的影响。神经元-小胶质细胞条件共培养后,HT22神经元正常组的细胞凋亡百分比最少和细胞活力最强,与对照组相比,白藜芦醇组和RTA-408组神经元细胞凋亡百分比减少且细胞活力增加,而ML385组和环王巴明组神经元细胞凋亡百分比减少明显增加且细胞活力明显降低。结论:Nrf2可能与Shh相互作用调控白藜芦醇促进OGD/R损伤后小胶质细胞向M2极化并抑制氧化应激损伤,同时小胶质细胞释放的介质调控周边神经元的凋亡和活力。