禽流感(Avian Influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)引起的禽类烈性传染病，世界各地都有AI的暴发和流行，给世界养禽业造成了巨大的经济损失。自1997年“香港禽流感”事件到目前为止，禽流感已造成了数百人感染及死亡，表明AI已经对人类健康构成了潜在的威胁，AI的研究具有重大公共卫生学意义。 目前AIV的诊断有病毒分离鉴定、血凝抑制、琼脂扩散和RT-PCR等方法，但上述方法由于耗时或操作复杂或需要昂贵仪器等缺点，难以在基层推广应用，因此AIV的快速诊断已成为目前迫切需要解决的问题之一。胶体金免疫层析快速检测AIV方法简便、快速、直观，而研制抗不同表位的单克隆抗体是该方法建立的必需前提。本研究研制了8份抗H9N2亚型AIV的单克隆抗体，效价高，特异性强，且分属于AIV的几个不同的抗原表位，是胶体金免疫层析法快速检测AIV的重要材料。 在研究敏感快速的诊断方法的同时，AI血清学抗体检测方法仍是重要的监测方法。本研究利用AIV核蛋白(Nucleoprotein，NP)具有型特异性的特点，建立了NP-ELISA抗体检测方法，可用于抗体的监测，为禽流感的流行病学调查提供了可靠的手段。 AIV血凝素(Hemagglutinin，HA)是诱导动物机体产生中和抗体的主要免疫原，也是决定病毒变异、毒力和宿主特异性的主要因素。利用HA基因或蛋白研制的疫苗可对同一亚型不同毒株的攻击产生近100％的保护作用。但是不同HA亚型抗体之间没有交叉反应和交叉保护性，这就给AI的检测和预防带来了困难，而M2抗原是在所有流感病毒中最为保守的蛋白之一，M2产生的抗体能够为机体提供针对不同亚型病毒攻击的保护力，而且能明显抑制病毒在呼吸道中的复制，因此M2蛋白是研究交叉保护性疫苗的理想候选抗原。本研究将HA蛋白和M2蛋白分别或融合表达，以期为发展具有高效和交叉免疫保护力的新型疫苗奠定基础。 AIV主要通过呼吸道和消化道侵入机体，因而粘膜免疫非常重要。霍乱毒素B亚单位(Cholera Toxin，CTB)可以有效诱发机体的粘膜免疫应答和分泌型IgA(Secretory IgA，sIgA)的产生。sIgA是粘膜免疫的主要效应因子，有抗蛋白酶水解作用，可长时间在消化道和呼吸道持续存在。特异性sIgA可在感染的最初阶段阻断禽流感病毒的侵入，因此，研究AIV主要抗原与粘膜免疫刺激物的互相作用，具有重要的理论意义和应用价值。 本项目以H9N2亚型AIV为研究对象，用现代分子生物学方法和技术，着重进行了AIV主要抗原基因的克隆和原核表达研究；重组AIV-HA、M2蛋白粘膜免疫机制研究；AIV主要抗原蛋白单克隆抗体研究；以AIV-NP表达蛋白为包被抗原，建立了NP-ELISA抗体检测方法。研究内容如下：