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(1)肝星状细胞的激活是肝纤维化进程的关键步骤,而TGF-β/Smads信号途径对肝星状细胞的激活尤为重要,Smad3是介导TGF-β信号向细胞内传递、活化肝星状细胞的直接承担者,在肝纤维化发展进程中起着关键作用。本文以大鼠Smad3基因为研究对象,第一步构建并筛选出有效沉默大鼠Smad3基因的干扰载体。(2)将有效沉默大鼠Smad3基因的干扰载体转染入大鼠星状细胞(hepatic setellate cells, HSC)HSC-T6中,下调表达Smad3基因,阻断TGF-β/Smads信号途径,通过体外试验观察对大鼠HSC的激活的影响,判断是否有抗纤维化。(3)将有效沉默大鼠Smad3基因的干扰载体通过转染入大鼠四氯化碳肝纤维化模型中,探讨下调表达Smad3基因对大鼠四氯化碳肝纤维化模型中肝纤维化指标的影响,从而探索肝纤维化治疗的新方法。(4)利用本实验室构建的ppGalNAc-T2的siRNA表达载体,观察ppGalNAc-T2下调后对大鼠肝星状细胞TGFβ1-Smad3激活途径相关基因表达的影响,从而初步探讨糖基转移酶ppGalNAc-T2对大鼠肝星状细胞的TGFβ1-Smad3信号激活影响。方法(1)利用互联网资源从基因库中获得Smad3基因序列,用ambion公司的siRNA设计工具,针对Smad3基因mRNA序列设计三条可能的小干扰RNA(siRNA),将这三条小干扰RNA插入到RNA干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中构建成三条干扰载体。将构建的3个带有荧光标记的Smad3干扰载体(pRNAT-siSmad3-1、pRNAT-siSmad3-2、pRNAT-siSmad3-3)并分别转染大鼠肝星状细胞株(HSC)中,通过RT-PCR,Western-Blot的方法筛选出最有效的Smad3基因的siRNA表达载体。(2)用脂质体2000转染试剂将最有效的Smad3 siRNA表达载体(pRNAT-siSmad3-2)转染入对数生长期的大鼠HSC(1.0μg plasmid/106 cells)中,48小时后,用trizol提取总RNA,用RT-PCR检测下调Smad3以后对HSC的Smad2,3,4及胶原I,III,IV mRNA表达的影响。(3)80只成年SD大鼠随机分成三组,对照组(30)模型组(30)治疗组(20),模型组和治疗组每周两次皮下注射40%(v/v)四氯化碳橄榄油(3 ml/kg),共8周。从第四周起用阳性脂质体将siRNA表达载体质粒(150μg/kg)在全麻,经皮下注入模型组大鼠肝右叶中,每两周一次,而模型组注入相同体积的缓冲剂。于第6、8周末,取得肝组织及血清,观察用纤维化半定量评分系统对病理切片的肝纤维化分级,及血清相关指标的影响。(4)在大鼠肝星状细胞中转染ppGalNAc-T2的siRNA表达质粒,用RT-PCR检测TGFβ1- Smad3信号途径相关基因mRNA的表达变化,Western blot以及免疫荧光方法检测Smad3基因蛋白表达变化。结果(1)成功构建到三个Smad3基因的有效siRNA干扰载体(pRNAT-siSmad3-1、pRNAT-siSmad3-2、pRNAT-siSmad3-3),并筛选出pRNAT-siSmad3-2为相对最佳的载体。(2)转染了pRNAT-siSmad3-2表达载体的肝星状细胞中Smad3和胶原I,III,IV mRNA表达都受到了明显抑制。(3)治疗组较模型组,病理切片用纤维化半定量评分系统观察到肝纤维化分级有明显减轻(P < 0.05),血清肝纤维化指标(III型前胶原,IV型胶原,层粘蛋白,透明质酸)亦有明显改善(P < 0.01)。(4)ppGalNAc-T2下调后肝星状细胞中Smad2,Smad3,Smad4,胶原3α1(collagen type III, alpha 1 ,Col3α1),转化生长因子β调节基因4(transforming growth factor beta regulated gene 4, Tbrg4 ),转化生长因子β1(transforming growthfactor beta, TGFβ1),转化生长因子β2(transforming growthfactor beta2, TGFβ2)及转化生长因子β受体3(transforming growth factor beta receptor3,Tgfβr3)的mRNA及Smad3的蛋白表达几乎没有变化(P﹥0.05),但转化生长因子β受体1(transforming growth factor, beta receptor 1,Tgfβr1)和转化生长因子β受体2(transforming growth factor beta receptor2,Tgfβr2)都有较大程度的降低(P<0.05)结论(1)转染pRNAT-siSmad3-2载体后,下调Smad3的表达,阻断TGF-β/Smad3信号途径,对大鼠HSC及四氯化碳肝纤维化模型有抗纤维化作用。(2)RNAi下调Smad3的表达可以作为肝纤维化基因治疗的实验依据。(3)在大鼠肝星状细胞中,ppGalNAc-T2下调对于TGFβ1-Smad3激活途径基因表达基本没有影响,其在肝星状细胞中的具体功能有待于进一步研究。