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甲醇营养型毕赤酵母表达系统近年来被广泛用于外源蛋白的大规模表达和生产,但其对重组蛋白的糖基化修饰与哺乳动物细胞产生的复杂型糖链有着明显区别。毕赤酵母合成的糖蛋白为30-50个甘露糖修饰的高甘露糖型蛋白,此类糖蛋白由于末端甘露糖修饰而容易被清除,导致体内半衰期缩短,对药理学性质包括生物学活性、受体结合力、抗体效应作用、药代动力学和免疫原性都有一定的影响,从而限制了毕赤酵母表达系统在药用重组糖蛋白的表达应用。为了改善毕赤酵母对蛋白的过度糖基化修饰,需要对毕赤酵母的N-糖基化途径进行改造。本研究的第一部分是根据哺乳动物细胞表达系统的N-糖基化途径对毕赤酵母的N-糖基化途径进行一系列改造,从而获得能够产生低糖基化杂合型糖链GlcNAcMan5GlcNAc2-Asn修饰的工程菌株。a-1,6甘露糖转移酶(OCH1)是毕赤酵母糖基化途径中区别于哺乳动物细胞的第一个关键酶,该酶识别Man8GlcNAc2的糖链末端并添加a-1,6-甘露糖形成Man9GlcNAc2寡糖连,然后以此寡糖作为底物继续添加一系列甘露糖,最终形成高甘露糖型。所以a-1,6甘露糖转移酶(OCH1)是导致高甘露糖型生成的关键酶,要阻断毕赤酵母的过度糖基化修饰,必须对OCH1基因进行敲除,作为毕赤酵母糖基工程改造的起始步骤。首先以野生型毕赤酵母KM71作为起始菌株,建立了MazF-ZeoR两步基因重组敲除OCH1基因的方法。利用MazF-ZeoR筛选标记和两步基因重组技术,实现了博莱霉素(zeocin)的循环使用。最终结合基因型和表型筛选获得了a-1,6-甘露糖转移酶OCH1基因敲除的工程菌株,糖链分析发现其高甘露糖修饰和不均一性明显降低,85%的糖链为Man8GlcNAc2糖型,说明Pichia Pastoris的过度糖基化被阻断。当具有Man8GlcNAc2寡糖结构的糖蛋白进入高尔基体后,位于高尔基体的a-1,2-甘露糖苷酶Ⅰ对其进行剪切而形成Man5GlcNAc2结构的糖链,该糖型是形成杂合型糖链的中间糖型。在毕赤酵母内合成具有此结构糖链的糖蛋白,需要引入外源的a-1,2-甘露糖苷酶Ⅰ来实现。本研究选择在精氨酸营养缺陷的毕赤酵母菌株内表达绿色木霉来源的a-1,2-甘露糖苷酶Ⅰ(Mns Ⅰ),使用酿酒酵母a交配因子替换其自身信号肽,该基因在C端融合内质网定位序列HDEL后转化入毕赤酵母Koch1(Δochl)工程菌株中表达,糖链分析结果显示68%糖型为Man5GlcNAc2中间结构,表明绿色木霉Mns I能够在毕赤酵母中发挥糖苷酶活性。内侧高尔基体形成的Man5G1cNAc2糖链转入中间高尔基体后,在β-1,2-N-乙酰葡萄糖转移酶Ⅰ(GnT I)的作用下生成杂合型糖链GlcNAcMan5GlcNAc2,然后进入外侧高尔基体,进一步形成复杂型糖链,完成哺乳动物双天线复杂型N-糖链的合成。为了实现β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ(GnT I)的表达需要引入外源的GnTⅠ,本研究将人源GnT I自身定位信号用酿酒酵母高尔基体定位信号mnn9取代后,在毕赤酵母KMochl (Δochl,+mds)中表达,对报告蛋白的糖链分析结果表明人源β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶I (GnT I)在毕赤酵母中成功表达,具有催化活性,催化效率为91%,最终成功获得了能够合成杂合型糖链GlcNAcMansGlcNAc2-Asn的工程菌株。第二部分是以第一部分的工作为基础,建立了高效表达WFDC2 (whey acidic protein four-disulfide)重组蛋白的工程菌株,并探讨不同糖基化修饰的WFDC2蛋白的生物活性的影响。WFDC2蛋白是由124个氨基酸组成的小分子分泌性糖蛋白,作为本研究N-糖基化改造的报告蛋白。该蛋白是由两个高度保守的乳清蛋白WAP结构域组成,具有该结构的蛋白可能具有抑菌活性和蛋白酶抑制作用,但WFDC2的生物活性尚未研究报道。本研究首先对哺乳动物细胞293F表达的WFDC2蛋白进行生物学活性研究,然后以其作为对照,对末端不同糖基化修饰(高甘露糖型、杂合型和复杂型)的WFDC2进行生物学活性探索和对比研究。结果显示WFDC2与多种微生物有一定的亲和作用,其中与金黄色葡萄球菌的亲和力较强,对其生长有微弱的抑制作用；WFDC2蛋白对多种蛋白酶均有一定的抑制作用,包括丝氨酸蛋白酶(胰酶和弹性蛋白酶)、基质金属蛋白酶和枯草杆菌分泌的蛋白酶,对MMP9的抑制作用较强。末端为高甘露糖型和杂合型糖基化修饰的WFDC2蛋白的生物学活性(包括对枯草蛋白酶、丝氨酸蛋白酶的抑菌作用)降低,其中末端为杂合型糖基化修饰的WFDC2蛋白(KMoGnT I-WFDC2)对胰酶的抑制作用与哺乳动物细胞293F表达的WFDC2蛋白活性相近,说明末端糖链的组成对蛋白的生物活性产生一定的影响。综上所述,经过对毕赤酵母的糖基工程改造,最终获得具有自主产权的,能够产生杂合型GlcNAcMansGlcNAc2-Asn糖型的工程菌株KMoGnT I,为进一步合成复杂型糖基提供结构基础；同时首次在体外发现WFDC2具有蛋白酶抑制作用,并对末端不同糖基化修饰对WFDC2蛋白生物活性的影响进行探讨,对于了解WFDC2的结构和功能的关系,及在生理病理中的作用提供研究线索和方向。