【摘 要】
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木质纤维素生物质的生物降解已受到广泛研究,有报告指出在自然界中能够修饰木质素的生物体中,白腐担子菌可能已经开发出迄今为止最有效的氧化系统,这是一个基于细胞外氧化还原酶的作用达到完成木质素分解的系统,在香菇及杏鲍菇等一系列白腐菌中均具有该系统,通过对木质素降解催化全过程机理的深入研究发现,木质素降解酶系中多功能过氧化物酶Versatile peroxidase（VP）因其广泛的底物催化特性以及较低的
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木质纤维素生物质的生物降解已受到广泛研究,有报告指出在自然界中能够修饰木质素的生物体中,白腐担子菌可能已经开发出迄今为止最有效的氧化系统,这是一个基于细胞外氧化还原酶的作用达到完成木质素分解的系统,在香菇及杏鲍菇等一系列白腐菌中均具有该系统,通过对木质素降解催化全过程机理的深入研究发现,木质素降解酶系中多功能过氧化物酶Versatile peroxidase（VP）因其广泛的底物催化特性以及较低的催化条件要求,逐渐成为近期木质素降解酶系中的研究热点,表现出极大的应用价值和前景。并且VP兼有木质素过氧化物酶Lignin peroxidase（Li P）和锰过氧化物酶Manganese peroxidase（Mn P）两者的特性,对VP的深入研究有助于更深入揭示木质素降解的催化机制。因此,本文对实验室中杏鲍菇3403菌株和香菇Gsm207,Bsm83,A2sm99及215sm280菌株的产酶规律进行研究,发现氮源限制培养条件可促进香菇胞外Li P,Mn P等过氧化物酶酶活水平。进一步以NCBI中获取的杏鲍菇VPL1 mRNA序列进行引物设计,以杏鲍菇3403菌株的c DNA为模板进行PCR扩增获得VPL1全长序列,并对3403菌株序列进行了相关分析。构建了GPVe P基因表达重组载体并利用农杆菌介导侵染小米粒转化法,获得了成功分泌VPL1蛋白的香菇转化子。研究其酶学性质结果显示:重组多功能过氧化物酶VPL1对各底物的动力学常数稍低于3403菌株;其对不同结构类型的染料均有较强脱色作用。其转录水平在12天至20天中逐步增加。综上所述,本论文获取了杏鲍菇3403多功能过氧化物酶基因,初步建立了粗酶液体系下快速稳定对木质素降解酶系的检测方法,通过平板显色法配置了适宜专用于香菇分泌Li P的限氮培养基。构建了农杆菌侵染小米粒转化表达体系并成功获得分泌活性多功能过氧化物酶蛋白的香菇转化子,对VPL1的性质功能进行了研究。本论文为香菇木质素降解酶系提供了一套快速简便的检测方法,也为揭示其表达调控及木质素降解分子机制提供了研究基础。
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