原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,主要包括胆管细胞癌和肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),其中HCC的发病率在原发性肝癌中所占的比例大约为90%。HCC是世界上最常见的一种具有侵袭性的人类恶性肿瘤,具有恶性程度高、早期诊断率低、预后差和复发率高的特点。尽管对HCC发生、发展过程的研究有了重大的进展,但是HCC病变的精确机制仍然不明确。在过去的几年中,HCC的5年生存率变化也不大。因此,HCC的早期诊断及治疗就变得尤为重要。MicroRNAs是一种微小RNA,由20到22个核苷酸组成,通过碱基之间进行互补配对从而与靶基因的mRNA结合,抑制靶基因翻译成相对应的蛋白质或者导致其降解,使之在RNA转录后对基因的表达进行调控。MicroRNA-320a(miR-320a)是miR-320家族中的一员,目前已经发现miR-320a存在于多种肿瘤中。除了在肿瘤中发挥基本的抑癌功能,miR-320a还参与了肿瘤放化疗以及药物治疗的基本过程,但是miR-320a对于HCC的影响及主要机制需要我们进行探讨研究。注射用核糖核酸Ⅱ(BP素)是一种能够增强人体免疫功能的药物,且该药物本身就是一种核糖核酸并且具有抗肿瘤的作用,在前期的研究中已通过基因芯片分析出该药物中含有多种微小RNA,其中就包括了mi R-320a,因此我们设想注射用核糖核酸Ⅱ抗肿瘤作用的发挥是否与miR-320a有关,肝癌细胞内miR-320a表达水平的改变,是否会影响注射用核糖核酸Ⅱ的抗肿瘤作用。目的本研究第一部分以人HCC细胞株SMMC-7721,Bel-7402,Hep3B,HepG2及正常肝细胞HL-7702和手术切除的人HCC组织及对应的癌旁组织为研究对象,检测mi RNA-320a在HCC中的表达水平及其对HCC的影响;第二部分研究miRNA-320a影响HCC的可能机制;第三部分研究miRNA-320a对注射用核糖核酸Ⅱ(BP素)诱导的HCC细胞凋亡和迁移的影响。为临床治疗HCC提供理论依据及药物靶点研究。方法第一部分:体外培养正常的人肝细胞株HL-7702及肝癌细胞株Bel-7402,SMMC-7721,Hep3B,HepG2,并收集人肝癌组织和其对应的癌旁组织,运用RT-PCR方法检测细胞和组织中的miR-320a表达水平;将miR-320a mimics转染到SMMC-7721和Bel-7402细胞中,48h后用RT-PCR技术检测mi R-320a的转染效率;用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测过表达miR-320a后,SMMC-7721和Bel-7402细胞的周期及凋亡的变化;划痕实验及Transwell法分析过表达miR-320a后SMMC-7721和Bel-7402细胞的迁移及侵袭能力;第二部分:通过Targetscan、microRNA.org和miRBase对miR-320a的靶基因进行生物信息学分析;通过化学合成,质粒构建进行荧光素酶报告分析;运用RT-PCR方法检测β-catenin在肝癌细胞株Bel-7402,SMMC-7721,Hep3B,HepG2中的表达水平及过表达miR-320a后β-catenin在SMMC-7721和Bel-7402细胞株中的表达水平;用免疫印迹法(Western-blot,WB)检测β-catenin蛋白的表达,Western-blot检测细胞周期蛋白CDK4、Cyclin D1,促凋亡蛋白Bax及蛋白酶Caspase3,抗凋亡蛋白Bcl-2,抑癌蛋白p53,癌基因MDM2,迁移相关蛋白基质金属蛋白酶MMP3、MMP9的表达;第三部分:RT-PCR检测注射用核糖核酸Ⅱ对Bel-7402细胞中miR-320a表达水平的影响;CCK-8法检测注射用核糖核酸Ⅱ对Bel-7402及Bel-7402-miR-320a细胞增殖的影响;FCM法检测注射用核糖核酸Ⅱ对Bel-7402及Bel-7402-mi R-320a细胞的周期及凋亡的影响;Transwell法检测注射用核糖核酸Ⅱ对Bel-7402及Bel-7402-miR-320a细胞迁移和侵袭能力的影响;Western-blot检测注射用核糖核酸Ⅱ对Bel-7402及Bel-7402-miR-320a细胞β-catenin蛋白,细胞周期蛋白Cyclin D1,促凋亡蛋白Bax,抗凋亡蛋白Bcl-2,抑癌蛋白p53,迁移相关蛋白MMP3表达的影响。结果第一部分1.RT-PCR结果显示:以正常肝细胞和对应的癌旁组织为对照,miR-320a在HCC细胞和组织中的表达水平明显降低;2.FCM结果显示:与对照组相比,过表达mi R-320a组细胞周期阻滞在G0/G1期及细胞凋亡率明显增高;3.划痕实验结果显示:在阴性对照组中,与0h相比24h和48h后划痕距离变窄,提示细胞具有较强的迁移能力;而在过表达miR-320a组中,与0h相比24h和48h后划痕距离变化不大,提示过表达miR-320a能抑制细胞的迁移能力;4.Transwell结果进一步显示:与对照组相比过表达miR-320a组细胞向营养成分高的膜外迁移和侵袭能力减弱。第二部分1.生物信息学分析及荧光素酶报告分析:β-catenin是miR-320a的靶基因;2.RT-PCR结果显示:以正常肝细胞HL-7702为对照,β-catenin在肝癌细胞株Bel-7402,SMMC-7721,Hep3B,Hep G2中的表达上调;而在SMMC-7721和Bel-7402两种细胞中过表达miR-320a后可以使β-catenin的表达下调;3.WB结果显示:过表达miR-320a可以明显抑制β-catenin蛋白(CTNNB1)的表达;4.WB结果显示:过表达miR-320a可以使周期蛋白CDK4、Cyclin D1,抗凋亡蛋白Bcl-2,癌基因MDM2的表达下调,抑癌蛋白p53,促凋亡蛋白Bax和蛋白酶Caspase3的表达上调,使迁移相关蛋白MMP3,MMP9的表达下调。第三部分1.RT-PCR结果显示:经注射用核糖核酸Ⅱ处理细胞后可使细胞中miR-320a表达量增加;2.CCK8结果显示:注射用核糖核酸Ⅱ对肝细胞肝癌Bel-7402及Bel-7402-miR-320a细胞的生长抑制作用呈剂量和时间依赖性,尤其是在过表达miR-320a后,药物的抑制作用更明显;3.FCM结果显示:过表达miR-320a后注射用核糖核酸Ⅱ对HCC细胞Bel-7402的G0/G1周期阻滞和促进HCC细胞Bel-7402凋亡的效果更明显;4.Transwell结果显示:与Control组相比,Bel-7402+注射用核糖核酸Ⅱ组细胞向含营养成分较高的膜外迁移和侵袭能力减弱,尤其在Bel-7402-miR-320a+注射用核糖核酸Ⅱ组中细胞的迁移和侵袭能力减弱更明显;5.WB结果进一步显示:注射用核糖核酸Ⅱ组中β-catenin蛋白的表达下调,凋亡周期蛋白及迁移相关蛋白的表达水平也有所改变,尤其是在过表达miR-320a组中其相对应的蛋白表达水平改变更明显。结论1.mi R-320a在HCC细胞及组织中低表达,过表达mi R-320a可以将细胞周期阻滞在G0/G1期并促进细胞的凋亡,同时还可以抑制细胞的迁移和侵袭;2.荧光素酶分析结果显示β-catenin是miR-320a的靶基因,且β-catenin在HCC细胞中表达上调,过表达miR-320a可明显下调HCC细胞内β-catenin的表达水平。miR-320a对HCC的生物学作用可能是通过抑制β-catenin的表达来实现的;3.上调miR-320a的表达水平后,可提高HCC细胞Bel-7402对注射用核糖核酸Ⅱ的敏感性,增强注射用核糖核酸Ⅱ对HCC细胞Bel-7402的作用。