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研究目的:
本课题是应用免疫组织化学染色技术,在蛋白质水平上研究hTERT基因在人胰腺癌组织中的表达及其与P-gp、Bcl-2、COX-2蛋白表达和临床病理特征的关系。利用RNAi技术靶向沉默胰腺癌细胞的hTERT基因表达,在基因水平上研究hTERT-siRNA对胰腺癌细胞的增殖、凋亡、细胞周期以及对P-gp、Bcl-2和COX-2基因表达的影响。
材料与方法:
材料
1.胰腺癌手术切除后存档的石蜡包埋标本38例,慢性胰腺炎标本25例,正常胰腺组织标本20例。
2.人胰腺腺癌Capan-2细胞株、SW1990细胞株。
方法
1.链菌素-生物素复合物免疫组织染色法:采用石蜡切片微波修复抗原染色程序检测hTERT、P-gP、COX-2、Bcl-2蛋白的表达,DAB显色。结果判断采用定性和半定量的方法。
2.胰腺癌的临床分期和组织分级标准:采用1997年国际抗癌协会制定的TNM临床分期标准,分为0,I,II,III,IV期。应用Kloppel组织分级标准:分1、2、3级。按手术记录描述肿瘤生长部位和大小。
3.Capan-2、SW1990细胞株应用RPMI1640培养基,置于含5%CO2,37℃的细胞培养箱中培养。
4.应用荧光标记的siRNA和Lipofectamine2000进行转染效率筛选实验。
5.应用细胞直接计数法和流式细胞术检测有效hTERT-siRNA序列对Capan-2细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响。
6.采用Trizol法进行总RNA提取。RIPA法进行总蛋白质的提取,BCA法进行蛋白质定量检测。
7.RT-PCR、RealtimePCR进行hTERT-siRNA有效序列的筛选和进行扩增检测hTERT、P-gP、COX-2、Bcl-2基因的mRNA表达水平,以β-Actin或GAPDH为内参照。
8.Westernblotting检测转染细胞中hTERT、P-gP、COX-2、Bcl-2蛋白表达水平,以β-Aetin为内参照。
9.统计学方法:计量资料采用均数±标准差表示,多组间均数比较采用方差分析,两组均数比较采用独立t检验:计数资料采用率或比表示,其比较采用t检验,频数的关联性应用Pearson列联系数rp表示。所有数据均在计算机SPSS10.0软件包上进行。
结果:
1.hTERT在人胰腺癌组织中的表达及其与P-gP、COX-2、Bcl-2蛋白表达和临床病理特征的关系
在38例胰腺癌组织中hTERT、P-gP、COX-2、Bcl-2阳性表达率分别为81.58%、52.63%、76.32%、57.90%,评分分别为6.04±1.08、4.50±1.75、5.96±1.60、5.61±1.08,而正常胰腺组织和慢性胰腺炎组织的hTERT与Bcl-2阳性率和评分均为0,在慢性胰腺炎P-gP、COX-2为低表达,阳性率分别为20.00%、24.00%,评分分别为1.21±0.86、3.59±1.42,在正常对照组阳性率分别15.00%、0,评分分别为0.90±0.58、0。胰腺癌组与其他组比较有统计学差异。
在胰腺癌组织中hTERT表达与P-gP、COX-2蛋白和Bcl-2蛋白表达分别有显著的正相关。
hTERT表达与肿瘤的部位、大小、分级无统计学差异,而与临床分期有显著性的正相关。
2.Lipo与siRNA最佳转染浓度筛选
应用Lipo转染试剂在同一优化条件下,Capan-2细胞可成功转染,平均转染效率>86%。但SW1990细胞用该试剂在同一条件下未转染成功。筛选siRNA的最佳浓度为50nm,Lipo最佳转染剂量为3μl/2ml转染体积中。
3.hTERT-siRNA沉默人胰腺癌Capan-2细胞hTERT基因的效率和最佳序列的筛选
siRNA001与siRNA002有很好沉默hTERT作用,以48h或72h小时为明显,沉默的效率为100%。与空白对照组相比,Capan-2细胞在转染后,其hTERT蛋白水平在转染48h和72h后被分别下调了94.34%和94.63%,而转染后24h抑制不明显,Lipo对照组和阴性对照组与空白对照组无明显差异。
4.hTERT-siRNA002沉默hTERT基因对人胰腺癌Capan-2细胞生长、细胞周期和凋亡的影响
hTERT-siRNA002的使用浓度为50nm,Lipo转染浓度为3μl/2ml转染体积,转染24h后,细胞生长已明显减慢,抑制细胞增殖率为26.39%,随着转染细胞按常规培养的时间延长,早期凋亡细胞明显增多,以24h后更明显;活性细胞明显减少,而损伤细胞明显增多,以6h后就明显;死亡细胞明显增多以24小时后更明显。siRNA组与阴性对照组和Lipo对照组均有明显差异。G0-G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,以24h后明显;G2-M期细胞明显减少,以48h后明显,晚期凋亡细胞增多,以48h后明显。
5.hTERT-siRNA002沉默hTERT基因对人胰腺癌Capan-2细胞的耐药、凋亡基因的影响
hTERT-siRNA002在上述沉默效应和同一沉默效率的基础上,同一措施处理细胞,COX-2、Bcl-2、P-gp基因mRNA表达的量在hTERT-siRNA002转染后48h均明显受到抑制,但在72h后均恢复至与对照组相似的水平,而阴性对照组与Lipo对照组的COX-2基因表达量呈上升趋势。
结论:
1.hTERT蛋白在人胰腺癌组织中呈高表达,阳性率为81.58%,而在慢性胰腺炎和正常组织中无表达。其表达与胰腺癌的临床分期有显著的正相关,而与肿瘤的部位、大小、分级无统计学差异。
2.在蛋白质表达水平上,hTERT与COX-2、P-gP、Bcl-2蛋白的表达均有显著的正相关性。
3.hTERT-siRNA001与002序列可完全沉默Capan-2细胞hTERT-mRNA的表达。
4.hTERT-siRNA可抑制人胰腺癌Capan-2细胞生长,使较多的细胞停留在G0-G1期,而进入G2-M期和S期的细胞减少,可促进细胞的早期凋亡与晚期凋亡。
5.hTERT-siRNA可短暂抑制人胰腺癌Capan-2细胞的COX-2、P-gP、Bcl-2基因的表达。