肠上皮组织作为机体的防御屏障之一,对抵御病原体及有害因子入侵起着重要作用。小肠上皮细胞更新迅速,对电离辐射十分敏感,由此造成的小肠结构和功能损伤的确切机制尚不清楚,从而制约了肠道辐射损伤的救治,也是腹部肿瘤放射治疗领域研究的重要课题。业已表明,电离辐射造成的肠隐窝干细胞及其干细胞龛损伤是肠损伤难以救治的关键机制。尽管目前已发现多种防护药物,如TLRs激动剂等,但如何维持肠区域稳态和保护肠干细胞机制尚不明了。共刺激分子及其介导的共刺激分子调节网络在免疫应答中起到了至关重要的作用。随着研究的深入,人们发现了一群介导免疫下调的负性分子,称之为免疫卡控点(Immune Checkpoints),包括B7H1、B7H3、B7H4等,起到维持免疫稳态为主的调节作用,并已证实可表达于多种免疫细胞及肿瘤组织中,介导肿瘤的免疫逃逸。我们前期的研究发现小肠组织表达B7H1和B7H4分子,但具体作用尚不清楚。鉴于此,本文以B7H1和B7H4分子在不同发育阶段小鼠肠道的表达规律及其与干细胞的相关性为研究基础,建立不同剂量照射造成的肠损伤模型,并采用TLR5激动剂CBLB502进行预防性干预,观测B7H1和B7H4分子在辐射损伤不同阶段肠组织中的表达及对干细胞的影响,以探讨辐射性肠损伤的生物学机制并寻找新的干预措施。第一部分B7H1和B7H4分子在小鼠不同发育阶段肠组织的表达目的分析B7H1和B7H4分子在C57BL/6J和Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠不同发育阶段肠道中的表达规律及其与肠干细胞的相关性。方法分别取出生0 w、1 w、3 w、6 w、9 w小鼠小肠和大肠,通过免疫组化观察B7H1和B7H4分子表达水平,进而通过免疫荧光探究其表达位置;并采用Lgr5-EGFP-ires-CreERT2转基因小鼠观察B7H1和B7H4分子的表达与Lgr5干细胞存在何种相关性;结果(1)B7H1和B7H4分子均自3 w开始表达于小肠(空肠、回肠)隐窝底部;(2)免疫荧光表明B7H1位于潘氏细胞内,B7H4位于潘氏细胞胞膜上,两者均不表达于Lgr5干细胞中;(3)结直肠组织未见B7H1和B7H4分子表达。结论本部分研究分别采用野生型c57和lgr5-egfp小鼠,明确了b7h1和b7h4分子在肠道表达的规律及表达位置,从而为下一步的研究奠定了基础。第二部分b7h1和b7h4分子在辐射性肠损伤中的表达及意义目的建立不同剂量照射所致的肠损伤模型,观察b7h1和b7h4分子的表达及其与肠损伤的相关性。方法将6~8wc57bl/6j小鼠分为对照、2gy、5gy、8gy、11gy照射组,给予照射组小鼠200cgy/min的x射线全身照射,取照后不同时间点(6h、1d、3d、5d、7d、10d、14d)的小鼠空、回肠样本,通过he染色观察小肠损伤程度;通过免疫组化和免疫荧光观察正常和受照小肠中b7h1和b7h4的表达水平变化。结果(1)2gy和5gy照射后3~5d小肠结构发生改变,至7d结构基本恢复正常,但5gy照射组恢复缓慢;8gy照射后小鼠存活时间缩短;小肠损伤7d开始恢复;11gy照射后3d小鼠全部死亡,呈现不可逆性损伤;(2)2gy照射后b7h1和b7h4分子在小肠隐窝组织表达未见明显变化;5gy照射3d后b7h1分子小肠隐窝组织潘氏细胞的表达下降,但随着小肠上皮损伤修复时(7d)还呈现表达,b7h4分子在照射后5d表达减少,未能见恢复性表达;(3)大剂量(8、11gy)照射后1~3d时b7h1和b7h4分子在小肠组织的表达明显减少,由于大剂量照射所导致小鼠全部死亡,未能观察到b7h1和b7h4分子表达的进一步变化。结论分别建立了不同剂量照射所造成的肠损伤模型,明确了小剂量照射后b7h1逐渐减少并随小肠结构的恢复而逐渐表达,同时明确了b7h4分子在5gy照射后未能恢复性表达,确切的机制仍需进一步的探讨;大剂量照射后b7h1和b7h4分子明显减少,小肠损伤不可逆,表明免疫卡控点参与辐射所致肠稳态失衡及损伤修复过程。第三部分b7h1和b7h4分子在tlr5激动剂cblb502对辐射性肠损目的采用tlr5激动剂cblb502对不同剂量造成的肠损伤进行预防性干预,观察b7h1和b7h4分子的表达变化及其对干细胞的作用。方法将lgr5-egfp小鼠及c57bl/6j小鼠分为对照、照射组及cblb502照射组,通过免疫荧光和Western Blotting检测小肠干细胞凋亡、增殖、B7H1和B7H4分子的表达变化。结果(1)照射前0.5 h腹腔注射CBLB502可使7 Gy X射线照射小鼠全部存活,明显提高9 Gy、10 Gy全身照射小鼠的存活率和体重;(2)照射前0.5 h注射CBLB502明显减少小肠上皮细胞及干细胞的凋亡,促进其增殖。(3)照射前0.5 h注射CBLB502显著地上调B7H1和B7H4分子在潘氏细胞中的表达,与肠辐射损伤存在相关性。结论证实了照射前0.5 h采用TLR5激动剂CBLB502对不同剂量照射所造成的肠损伤进行干预可上调B7H1和B7H4分子的表达,提示CBLB502对肠辐射损伤的防护可能与上调表达B7H1和B7H4分子,维护组织稳态,促进损伤修复相关。综上所述,本文明确了B7H1和B7H4分子在发育不同阶段小鼠肠道的表达规律及其与干细胞的相关性。并在此基础上建立了不同剂量照射造成的肠损伤模型,继而采用TLR5激动剂CBLB502进行预防性干预,观测到小剂量照射后B7H1逐渐减少并随小肠结构恢复逐渐表达,而B7H4分子在5 Gy照射后未能恢复性表达,大剂量照射后B7H1和B7H4分子明显减少,小肠损伤不可逆。采用TLR5激动剂CBLB502对不同剂量照射所造成的肠损伤进行干预可上调B7H1和B7H4分子的表达,提示CBLB502对肠辐射损伤的防护可能通过上调表达B7H1和B7H4分子,明显减少小肠上皮细胞及干细胞的凋亡,促进其增殖从而提高照射小鼠的存活率和体重。可见负性共刺激分子B7H1和B7H4可维持小肠区域稳态、保护小肠干细胞免受免疫攻击,同时促进辐射所致肠损伤的修复过程。