由苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）引起的苹果树腐烂病,是苹果上的一种毁灭性真菌病害。一旦病菌侵入到苹果树枝干的韧皮部和木质部,生产上只能利用外科手术及化学药剂进行防治,但是化学药剂由于很难达到树皮和树干深层,无法很好的控制病害,从而导致生产上严重的产量和经济损失。因此,解析苹果黑腐皮壳菌的致病机制对于开发新的腐烂病防治策略具有重要意义。病原菌通过G蛋白所调控的cAMP/PKA（the cyclic AMP/protein kinase A）信号转导途径对外界的变化做出改变,从而调控病原真菌的致病性。G蛋白,G蛋白调控因子（RGS）,以及PKA是G蛋白-cAMP-PKA信号通路的三个重要组成部分。本论文借助苹果黑腐皮壳菌全基因组测序信息,对苹果黑腐皮壳菌G蛋白α亚基、RGS和蛋白激酶A的两个催化亚基开展研究,明确它们在苹果黑腐皮壳菌生长发育以及侵染致病等过程中的作用。该研究为全面揭示苹果黑腐皮壳菌的致病机理奠定基础,进而为制定苹果树腐烂病防治新策略,提供重要的理论依据。主要研究结果如下:1.苹果黑腐皮壳菌G蛋白α亚基Gvm2和Gvm3基因的鉴定和功能分析G蛋白可以通过调控cAMP/PKA通路,参与到真菌的营养生长、产孢、致病等生理过程。本研究中,我们从V.mali中鉴定到两个异源三聚体G蛋白α亚基Gvm2和Gvm3。通过构建gvm2和gvm3突变体菌株发现Gvm3对于V.mali营养生长的调控非常重要。敲除该基因其生长速率降低了20%。此外,Gvm2和Gvm3参与调控病菌无性繁殖,gvm2和gvm3突变体菌株的分生孢子器数量显著下降,并且突变体对活性氧和细胞膜压力高度敏感。有趣的是,这两个G蛋白α亚基均影响苹果黑腐皮壳菌的毒性。在苹果‘富士’叶片的侵染试验中,接种敲除突变体gvm2和gvm3后,叶片病斑大小与野生型相比分别降低了40%和35%。接种苹果枝条后突变体病斑长度也分别降低了28%和33%。在苹果树腐烂病菌中细胞壁降解酶是一种重要的毒性因子。定量结果显示与野生型菌株相比,包括果胶降解酶,纤维素酶和半纤维素酶等水解酶编码基因在突变体菌株gvm2和gvm3中的表达降低。这表明,Gvm2和Gvm3可能通过调控细胞壁降解酶基因的表达来影响苹果黑腐皮壳菌的毒性。为了进一步分析gvm2和gvm3突变体对cAMP/PKA信号通路的影响,我们分析了cAMP/PKA信号通路基因的转录水平。结果发现在两个突变体菌株中腺苷酸环化酶VmAC,PKA调控亚基VmPKR,和PKA催化亚基VmPKA1都下调表达。另外,检测发现在gvm3突变体中胞外cAMP水平和PKA活性均降低,而在gvm2突变体中没有显著变化。这些结果表明,Gvm2和Gvm3参与到了对cAMP/PKA信号通路的调控,Gvm3可能发挥更重要的作用。综上表明,Gvm2和Gvm3在调控苹果黑腐皮壳菌的营养生长,无性繁殖和毒性中发挥重要作用。2.G蛋白调控因子（RGS）蛋白在苹果黑腐皮壳菌发育和抗逆过程中起重要的作用RGS蛋白作为一类多功能蛋白家族,通过负调控G蛋白在信号通路中起到了关键的调节作用。本研究中,我们从苹果黑腐皮壳菌中鉴定到6个RGS基因,通过定量筛选发现其中3个RGS基因（VmFlbA,VmRgsA,and VmRgsB）在致病过程中显著上调表达。通过构建敲除突变体发现VmFlbA和VmRgsA的营养生长速率显著下降。另外VmflbA突变体菌丝较于野生型菌株03-8稀疏,而VmrgsA突变体菌丝较于野生型菌株03-8浓密,但VmrgsB突变体的生长速率和菌丝形态与野生型菌株03-8相比无显著差异。相较于野生型菌株03-8,VmflbA突变体菌体变黑,检测发现黑色素合成基因的表达水平升高,表明VmFlbA在苹果黑腐皮壳菌的黑色素生物合成中起到负调控作用。另外,VmflbA和VmrgsA突变体对于渗透压、氧化压力和细胞膜压力的敏感性降低。我们还发现VmFlbA和VmRgsA参与苹果黑腐皮壳菌毒性的调控。在苹果富士叶片和枝条的侵染试验中,与野生型相比,敲除突变体VmflbA和VmrgsA造成的病斑显著减小。然而,VmrgsB突变体的毒性没有明显改变。我们选取对致病力影响最大的VmflbA突变体菌株进行了转录组测序分析发现,Gvm3表达量显著升高,这表明VmFlbA可能对Gvm3具有负调控作用。另外,包括水解酶在内的大量致病相关基因,在VmFlbA突变体中的表达水平降低。综上分析发现,VmFlbA和VmRgsA蛋白参与调节苹果黑腐皮壳菌的营养生长、菌丝形态、非生物胁迫和致病。3.蛋白激酶A（PKA）催化亚基在苹果黑腐皮壳菌中的作用在前期研究中我们克隆了两个苹果黑腐皮壳菌PKA催化亚基VmPKA1和VmPKA2并发现二者能够参与G蛋白α亚基Gvm3调控的cAMP-PKA信号通路。因此,本研究进一步解析了VmPKA1和VmPKA2在苹果黑腐皮壳菌中的功能以及在cAMP-PKA信号通路中的作用。通过结构域分析发现,VmPKA1和VmPKA2编码典型的PKA催化亚基,具有高度保守的蛋白激酶结构域。为了明确VmPKA1和VmPKA2的基因功能,我们构建了这两个基因的突变体。结果表明与野生型相比,苹果黑腐皮壳菌Vmpka1突变体表现出菌丝形态缺陷,分生孢子数量、生长速率降低和毒性的丧失。Vmpka2突变体的生长速率,毒性和菌丝形态与野生型03-8相似,另外分生孢子的产生显著下降。此外,在黑腐皮壳菌中VmPKA1对高温、渗透和SDS胁迫反应起到负调控作用。有趣的是,当在25℃培养40天,Vmpka1突变体形成快速生长的扇形区域。此外,对Vmpka1和Vmpka2突变体菌株的PKA活性进行检测显示VmPKA1基因贡献了主要的PKA活性,而敲除VmPKA2基因对PKA活性没有明显影响。Vmpka1突变体菌株的缺陷可能是由于PKA活性的丧失导致的。以上这些研究结果表明VmPKA1和VmPKA2在苹果黑腐皮壳菌的生长发育、毒性、分生孢子形成和压力胁迫方面发挥重要作用,但功能上存在差异。