目的：肿瘤的发展和转移总是伴随肿瘤新生血管的形成,肿瘤新生血管的过程包括肿瘤细胞、肿瘤基质细胞、内皮细胞、细胞外基质及相关细胞因子网络相互作用的过程。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)被认为是最重要的促血管生成因子,VEGF通过后续复杂的分子机制调控血管生成。而核因子TR3在多种肿瘤细胞高表达,本实验室前期研究已经证实TR3在VEGF介导的血管生成中发挥了关键性作用,有研究发现整合素(Integrin, ITG)与VEGF介导的血管生成过程密切相关。而TR3介导血管生成的过程是否有整合素参与,或者是否通过整合素介导?本研究针对上述疑问,提出假设：TR3通过调控整合素而调控下游血管生成,本研究采用人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)作为研究对象,旨在研究整合素在TR3介导血管生成中的作用和下游机制,进一步完善TR3介导血管生成的分子机制,为将来寻找新的抗肿瘤血管生成治疗靶点研究提供新的线索和思路。方法：1.采用Q-PCR和Western-Blot方法在mRNA和蛋白质水平研究TR3及促血管活性因子VEGF和组胺在HUVEC对整合素的影响；2.为明确整合素在TR3介导血管生成过程中所起作用,对TR3诱导上调的整合素,构建shRNA病毒载体下调其表达,而对TR3诱导下调的整合素,构建其cDNA过表达病毒载体,用此病毒载体感染TR3 cDNA过表达的HUVEC细胞,检测血管生成关键功能的变化。采用单层细胞划痕实验检测内皮细胞迁移活性,采用结晶紫染色法检测内皮细胞粘附功能,采用CCK-8试剂盒检测内皮细胞增殖能力；3.采用Western Blot方法对整合素下游信号传导分子进行筛选；4.构建TR3不同结构域和氨基酸位点删失突变体,通过Q-PCR检测相应整合素转录,通过Western Blot检测相应整合素表达水平来研究TR3蛋白调控整合素的关键氨基酸位点；5.采用启动子Mapping方法,构建包含不同长度整合素启动子片段的质粒,应用双荧光素酶报告基因法检测启动子活性来研究TR3与整合素启动子结合而调控整合素表达的关键位点；6.统计分析采用SPSS 21.0软件分析统计数据,统计描述采用均数±标准差,两组数据的比较采用两个独立样本的非参数检验(Mann-Whitney检验),双侧p值≤0.05被认为有统计学意义。结果：1.在TR3蛋白过表达的HUVEC细胞,ITGα1和ITGβ5蛋白表达升高,ITGa2和ITGP3蛋白表达减少；2. VEGF刺激HUVEC细胞后,ITGα1和ITGα2表达增加,ITGβ3蛋白表达减少,而ITGP5先一过性减少,之后表达增加；组胺刺激的HUVEC细胞,ITGα1和ITGβ5蛋白表达增加,ITGa2和ITGP3蛋白表达减少；而通过shTR3抑制HUVEC细胞中TR3蛋白表达后,发现VEGF对上述整合素蛋白水平的调节作用明显减弱；3.在TR3过表达的HUVEC细胞,抑制ITGα1蛋白表达发现HUVEC细胞粘附功能和增殖能力减弱,而迁移能力无明显变化；增加ITGα2表达发现内皮细胞粘附功能、增殖能力和迁移能力均减弱；而增加ITGβ3表达对上述功能均没有影响,而抑制ITGβ5表达发现细胞粘附功能和增殖能力增强,而细胞迁移能力减弱；4.在TR3过表达HUVEC,与对照组相比,过表达ITGa2发现细胞内pAKT蛋白表达增加,而Cyclin D1、pMAPK 42/44和FAK蛋白表达减少；5.构建不同TR3结构域删失突变腺病毒载体,通过Q-PCR和Western Blot检测相应整合素的表达,显示TR3蛋白N端转录活化域(transcriptional activation domain, TAD)或DNA结合域(DNA-binding domain, DBD)结构域删失(TR3ΔTAD和TR3ΔDBD)后,TR3删失突变体失去调控整合素能力,而删失配体结合域(Ligand binding domain, LBD)的TR3删失突变体(TR3ΔLBD)则能和TR3一样使HUVEC细胞表达ITGα1和ITGβ5升高,而ITGα2和ITGβ3下降；6.对TR3蛋白质N端每20个氨基酸依次删失突变体的分析显示：过表达TR3△(1-20)、TR3△(21-40)和TR3△(61-80)与TR3过表达一样使HUVEC细胞表达ITGα1和ITGβ5升高,而表达ITGa2和ITGβ3下降；而过表达TR3△(41-60)和TR3△(81-100),发现细胞表达ITGα1和ITGβ5轻度升高,但是较TR3及其他TR3删失突变体升高程度明显为低；7.针对TR3蛋白SER351磷酸化调节,我们构建了模拟丝氨酸351位点持续去磷酸化状态的TR3-351A和持续磷酸化状态的TR3-351D,并构建了失去Abox结构的TR3-GRR,结果显示过表达TR3-351A后观察到HUVEC表达ITGα1和ITGβ5升高,而表达ITGa2和ITGβ3下降；过表达TR3-351D后,HUVEC细胞表达ITGα1和ITGβ5升高,而表达ITGα2和ITGβ3无明显变化,而过表达TR3-GRR发现HUVEC细胞ITGα1、ITGa2、ITGβ3和ITGβ5表达无明显变化；8.对整合素启动子分析发现在ITGalp-410/+55启动子截去-150至-130位碱基后,TR3过表达对ITGα1启动子上调的效应消失；结论：1.TR3与促血管生成的因子VEGF和组胺都能调控整合素的表达,而VEGF对整合素的调控是通过TR3介导；2.整合素参与调控TR3介导的血管生成过程,ITGa2是TR3介导血管生成关键的调控分子,TR3通过下调ITGa2促进内皮细胞粘附增殖及迁移,而介导血管生成,而CyclinD1, pAKT, pMAPK 42/44和FAK等信号传导通路分子可能参与此过程；3.TR3调控整合素表达的关键结构域是TAD和DBD；4.TR3蛋白调控整合素表达的关键氨基酸位点在N端第41-60和第81-100位氨基酸；5.TR3蛋白的A box结构对其调控整合素的功能至关重要,而SER351的去磷酸化状态对其调控ITGα2和ITGβ3表达也是必需的；6. ITGα1启动子-150至-130碱基序列可能是TR3调节整合素表达的关键位点。本研究对TR3调控血管生成的下游机制及其与整合素的关系进行了较深入探讨,发现了ITGα2在其中发挥了关键作用,并对TR3结构与其调控整合素表达的功能进行了研究,找到了TR3蛋白调控整合素表达的关键位点和TR3调控整合素α1启动子的关键碱基序列,为下一步以此为基础的血管靶向治疗奠定了一定的理论基础和实验基础。目的：肿瘤新生血管的形成是肿瘤的重要标志之一,肿瘤新生血管的过程包含了肿瘤细胞、内皮细胞、肿瘤基质细胞、内皮细胞外基质及相关细胞因子网络等相互作用的复杂过程。很多信号通路参与其中,而VEGF介导的信号通路是最重要的血管生成信号通路,而核受体TR3在很多种肿瘤细胞高表达,本实验室前期研究已经证实TR3在VEGF介导的血管生成中起到关键性作用,也有大量研究证实Notch信号传导通路在肿瘤新生血管生成中发挥重要作用,那么是否Notch信号传导通路参与了TR3介导的血管生成呢?同时,本研究第一部分已经明确整合素参与了TR3介导的血管生成并在其中起到关键性作用,整合素和Notch信号传导通路在TR3介导的血管生成过程中是否存在相互作用?本研究采用HUVEC细胞作为研究对象,旨在研究Notch信号传导通路的两个关键配体DLL4和Jag1在TR3介导血管生成中所起的作用,及其与整合素的相互作用及关系,从而进一步完善TR3调控血管生成的分子机制,并为下一步寻找新的抗肿瘤血管生成治疗靶点研究提供新的思路。研究方法：1.用Western-Blot方法在蛋白质水平研究TR3及促血管活性因子VEGF和组胺对HUVEC细胞DLL4和Jag1蛋白表达的影响；2.为明确DLL4和Jag1在TR3介导血管生成过程中所起作用,对TR3诱导上调的蛋白,构建shRNA病毒载体下调其表达,而对TR3诱导下调的蛋白,构建其cDNA过表达病毒载体,用此病毒载体感染TR3过表达的HUVEC细胞,并行血管生成关键的功能检测以明确DLL4和Jag1对血管生成的影响。采用单层细胞划痕实验检测细胞迁移性,采用结晶紫染色法检测细胞粘附功能,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力；3.采用Western Blot方法对DLL4和Jag1下游信号传导分子进行筛选；4.在TR3过表达的HUVEC细胞,用Western Blot方法在蛋白质水平检测DLL4和Jag1与ITGα1、ITGα2、ITGβ3和ITGβ5的相互影响；5.构建TR3不同结构域和氨基酸位点删失异构体,通过Western Blot检测DLL4和Jagl蛋白表达水平来研究TR3蛋白调控DLL4和Jag1的关键氨基酸位点；6.统计分析：采用SPSS 21.0软件分析统计数据,统计描述采用均数±标准差,两组数据的比较采用两个独立样本的非参数检验(Mann-Whitney检验),双侧p值≤0.05被认为有统计学意义。研究结果：1.在TR3过表达的HUVEC细胞,DLL4和Jagl蛋白表达减少；2.在VEGF和组胺处理的HUVEC细胞,DLL4蛋白表达增加而Jag1蛋白表达减少；3.通过shTR3抑制HUVEC细胞中TR3蛋白表达后,发现VEGF对DLL4和Jag1蛋白水平的调节作用明显减弱；4.在TR3过表达的]IUVEC细胞,相比对照组,增加Jag1表达发现HUVEC细胞粘附能力减弱,而迁移能力和增殖能力无明显变化；增加DLL4表达,发现HUVEC细胞增殖能力和粘附能力均减弱；而减少DLL4表达发现HUVEC细胞增殖能力和粘附能力均增强；5.在TR3过表达HUVEC,与对照组相比,过表达DLL4发现细胞内pMAPK42/44蛋白表达明显增强；6.在TR3过表达的HUVEC细胞,减少ITGβ5发现DLL4和Jag1表达增加,减少ITGα1发现DLL4表达增加而Jag1表达减少,增加ITGβ3发现DLL4表达减少,Jag1表达无变化；增加ITGa2发现DLL4表达减少而Jag1表达增加；而在TR3过表达的HUVEC细胞,过表达DLL4和Jag1发现ITGα1、 ITGα2, ITGβ3和ITGβ5表达无明显变化；7.构建不同TR3结构域删失突变腺病毒载体,通过Western Blot检测相应DLL4和Jagl蛋白表达,TR3ΔTAD和TR3ΔDBD过表达的HUVEC细胞,与对照组相比,发现DLL4和Jagl表达无明显变化,而TR3ALBD过表达的细胞则发现DLL4和Jagl蛋白表达均减少；8.对TR3蛋白质N端每20个氨基酸依次删失突变体的分析显示,与对照组空病毒载体Lac-Z组相比,TR3Δ(1-20)、TR3A(21-40)和TR3△(61-80)过表达的HUVEC细胞与TR3过表达一样,能够下调Jagl和DLL4表达,而TR3△(41-60)和TR3△(81-100)过表达的HUVEC细胞与对照组相比DLL4和Jagl蛋白表达变化不明显；9.针对SER351磷酸化调节,我们构建了持续去磷酸化状态的TR3-351A和持续磷酸化状态的TR3-351D,并构建了失去A box结构的TR3-GRR,结果显示：TR3-351A过表达的HUVEC细胞与对照组相比DLL4和Jag1蛋白表达明显减少：而TR3-351D过表达HUVEC细胞可以观察到DLL4蛋白表达轻微减少,而Jag1蛋白表达不变,而在TR3-GRR过表达的HUVEC细胞则发现DLL4和Jag1蛋白表达无明显变化；结论：1.TR3和促血管活性因子VEGF、组胺都能调控DLL4和Jag1表达；而VEGF对DLL4和Jag1的调控主要通过TR3介导,DLL4可能是TR3介导病理性血管生成的标志性蛋白；2.DLL4和Jag1参与TR3调控血管生成的下游机制,DLL4是这个过程的关键分子,TR3通过下调DLL4而调控病理性血管生成；3.TR3对DLL4的调控通过ITGα1和ITGβ5发挥效应,TR3对Jagl的调控通过ITGa2和ITGβ5发挥效应,TR3可通过TR3→ITGα1 ITGβ5→DLL4通路而调控血管生成,即TR3通过上调ITGα1或ITGβ5表达从而下调DLL4表达从而促进血管生成；而pMAPK 42/44信号分子可能参与了DLL4、Jagl对血管生成的调控；4.TR3调控DLL4和Jag1表达的关键结构域是TAD和DBD；5.TR3蛋白调控DLL4和Jag1表达的关键氨基酸位点在N端41-60和81-100位氨基酸；6.TR3蛋白的A box结构对其调控整合素的功能至关重要,而SER.351的去磷酸化状态对其调控DLL4和Jag1表达也是必需的；本研究对TR3调控血管生成的下游机制及其与Notch信号传导通路的关系进行了深入探讨,发现了DLL4在其中发挥关键性作用,发现了TR3可通过TR3→ITGa1、ITGP5→DLL4通路而调控血管生成,并找到了TR3蛋白调控Notch信号通路的关键氨基酸位点,并初步探讨了TR3调控的病理性血管生成与VEGF信号传导通路调控的生理性血管生成的不同机制,进一步完善了TR3调控血管生成的下游机制,并为下一步以此为基础的血管靶向治疗奠定了一定的理论基础与实验基础。