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肝细胞癌(HCC)中具有肿瘤干细胞(CSCs)性质(以下简称干性)的细胞是导致HCC难以根治的根本原因。表观遗传调控涉及到HCC细胞干性特征的维持。紫花牡荆素(CAS)是蔓荆子的一种多甲基类黄酮，具有多种药理活性，包括抗癌作用。我们团队前期研究发现，CAS具有抑制CSCs自我更新的药理作用。利用GEO数据库进行DNA甲基转移酶1(DNMT1)和miR-148a-3p在HCC中的表达差异以及对HCC患者预后影响的生物信息学分析提示：在HCC组织中，DNMT1高表达，miR-148a-3p低表达，两者呈负相关。此外，HCC患者生存曲线分析显示：DNMT1低表达或miR-148a-3p高表达与HCC患者总体生存率升高相关。据此，我们假设：在HCC中，DNMT1和miR-148a-3p相互负调控促进HCC细胞的干性特征，同时，CAS可中断这个负反馈调节环路抑制HCC细胞干性特征，从而发挥抗HCC的生物学活性。
为了验证以上科学假说，我们首先以正常胚胎肝细胞(LO2)为对照，利用称之为HCC细胞干性特征评价体系的一系列实验，多角度评估两个不同HCC细胞系(MHCC97H和SK-Hep-1)的干性特征。该评价体系包括：流式细胞术、westernblot、RT-qPCR检测细胞干性相关标记物(CD44、EpCAM、Bmi1、Nanog和Oct4)表达，肿瘤球形成率测定和软琼脂集落形成试验评价细胞自我更新能力和锚定非依赖生长能力。接着，我们用DNA甲基转移酶活性检测试剂盒、RT-qPCR和westernblot检测HCC细胞的DNMT1活性以及DNMT1和miR-148a-3p的表达。然后，我们使用慢病毒递送系统和小分子RNA转染体系操纵DNMT1或miR-148a-3p的表达水平，再利用前述的HCC细胞干性特征评价体系，分析DNMT1或miR-148a-3p对HCC细胞干性特征的影响。接下来，我们利用甲基化特异性PCR(MSP)、荧光素酶报告基因试验等，鉴定DNMT1和miR-148a-3p之间相互作用方式，并分析miR-148a-3pmimic处理DNMT1过表达的HCC细胞或DNMT1抑制剂地西他滨(DAC)处理转染miR-148a-3pmimic的HCC细胞干性特征的变化，论证DNMT1和miR-148a-3p的相互作用与HCC细胞干性特征的关联性。之后，我们用筛选出的亚细胞毒浓度CAS处理HCC细胞，确定CAS对HCC细胞干性特征的作用。我们还分析CAS处理后，HCC细胞DNMT1活性以及DNMT1和miR-148a-3p表达的变化。此外，我们用CAS处理过表达DNMT1或miR-148a-3pmimic转染的HCC细胞，分析CAS抑制HCC细胞干性特征的分子机制。最后，我们还实施CAS和agomir-148a-3p单独或联合处理的裸鼠移植瘤实验。通过以上体外和体内的实验以揭示CAS干预HCC细胞干性特征的新药理机制。
结果显示：HCC细胞中存在部分细胞表现为干性相关标记物(CD44、EpCAM、Bmi1、Nanog和Oct4)表达更高，球形成和软琼脂集落形成能力更强，即更显著的干性特征，且HCC细胞DNMT1活化(活性和表达增高)，低表达miR-148a-3p。过表达DNMT1提升HCC细胞干性特征，敲低DNMT1的作用则正好相反。转染miR-148a-3pinhibitor能强化HCC细胞的干性特征，然而，转染miR-148a-3pmimic显著减弱HCC细胞干性特征。MSP和RT-qPCR证实：过表达DNMT1增强HCC细胞miR-148a-3p的启动子甲基化且沉默miR-148a-3p的表达。TargetScan计算机模拟和荧光素酶报告基因分析确认：DNMT1是miR-148a-3p直接功能靶标。miR-148a-3pmimic抑制HCC细胞DNMT1的活性和表达。此外，我们还发现：miR-148a-3pmimic逆转DNMT1过表达对HCC细胞干性特征的增强作用，DAC增强miR-148a-3pmimic对HCC细胞干性特征的抑制作用。
在研究CAS抗HCC药理作用及机制的实验中，我们发现CAS抑制HCC细胞(MHCC97H和SK-Hep-1)活力，但不影响LO2细胞生存。亚细胞毒性浓度的CAS可以显著抑制HCC细胞干性特征，并减弱DNMT1的表达和活性，增强miR-148a-3p表达。过表达DNMT1逆转CAS抑制HCC细胞干性特征的效应。转染miR-148a-3pmimic联合CAS协作性减弱HCC细胞干性特征。裸鼠移植瘤实验结果显示：单独的CAS或agomir-148a-3p抑制MHCC97H荷瘤裸鼠移植瘤生长，联合CAS和agomir-148a-3p的抑制作用增强。移植瘤组织的免疫组化染色显示：联合处理组的DNMT1和CD44蛋白表达比单独处理组更低。我们还发现：DNMT1活性以及DNMT1和CD44的mRNA水平在不同的处理组均有下降，但联合处理组的降低最显著，而且，随着DNMT1的减少，miR-148a-3p相应增加，另外，没有检测出DNMT3a和DNMT3b活性的显著变化。
综合以上结果，得出结论如下：
1.DNMT1和miR-148a-3p之间相互负性调控促进和维持HCC细胞干性特征是HCC发生和演进的重要病理机制之一。
2.通过中断DNMT1和miR-148a-3p之间相互负性调控抑制HCC细胞干性特征是CAS抗HCC的药理机制之一。
为了验证以上科学假说，我们首先以正常胚胎肝细胞(LO2)为对照，利用称之为HCC细胞干性特征评价体系的一系列实验，多角度评估两个不同HCC细胞系(MHCC97H和SK-Hep-1)的干性特征。该评价体系包括：流式细胞术、westernblot、RT-qPCR检测细胞干性相关标记物(CD44、EpCAM、Bmi1、Nanog和Oct4)表达，肿瘤球形成率测定和软琼脂集落形成试验评价细胞自我更新能力和锚定非依赖生长能力。接着，我们用DNA甲基转移酶活性检测试剂盒、RT-qPCR和westernblot检测HCC细胞的DNMT1活性以及DNMT1和miR-148a-3p的表达。然后，我们使用慢病毒递送系统和小分子RNA转染体系操纵DNMT1或miR-148a-3p的表达水平，再利用前述的HCC细胞干性特征评价体系，分析DNMT1或miR-148a-3p对HCC细胞干性特征的影响。接下来，我们利用甲基化特异性PCR(MSP)、荧光素酶报告基因试验等，鉴定DNMT1和miR-148a-3p之间相互作用方式，并分析miR-148a-3pmimic处理DNMT1过表达的HCC细胞或DNMT1抑制剂地西他滨(DAC)处理转染miR-148a-3pmimic的HCC细胞干性特征的变化，论证DNMT1和miR-148a-3p的相互作用与HCC细胞干性特征的关联性。之后，我们用筛选出的亚细胞毒浓度CAS处理HCC细胞，确定CAS对HCC细胞干性特征的作用。我们还分析CAS处理后，HCC细胞DNMT1活性以及DNMT1和miR-148a-3p表达的变化。此外，我们用CAS处理过表达DNMT1或miR-148a-3pmimic转染的HCC细胞，分析CAS抑制HCC细胞干性特征的分子机制。最后，我们还实施CAS和agomir-148a-3p单独或联合处理的裸鼠移植瘤实验。通过以上体外和体内的实验以揭示CAS干预HCC细胞干性特征的新药理机制。
结果显示：HCC细胞中存在部分细胞表现为干性相关标记物(CD44、EpCAM、Bmi1、Nanog和Oct4)表达更高，球形成和软琼脂集落形成能力更强，即更显著的干性特征，且HCC细胞DNMT1活化(活性和表达增高)，低表达miR-148a-3p。过表达DNMT1提升HCC细胞干性特征，敲低DNMT1的作用则正好相反。转染miR-148a-3pinhibitor能强化HCC细胞的干性特征，然而，转染miR-148a-3pmimic显著减弱HCC细胞干性特征。MSP和RT-qPCR证实：过表达DNMT1增强HCC细胞miR-148a-3p的启动子甲基化且沉默miR-148a-3p的表达。TargetScan计算机模拟和荧光素酶报告基因分析确认：DNMT1是miR-148a-3p直接功能靶标。miR-148a-3pmimic抑制HCC细胞DNMT1的活性和表达。此外，我们还发现：miR-148a-3pmimic逆转DNMT1过表达对HCC细胞干性特征的增强作用，DAC增强miR-148a-3pmimic对HCC细胞干性特征的抑制作用。
在研究CAS抗HCC药理作用及机制的实验中，我们发现CAS抑制HCC细胞(MHCC97H和SK-Hep-1)活力，但不影响LO2细胞生存。亚细胞毒性浓度的CAS可以显著抑制HCC细胞干性特征，并减弱DNMT1的表达和活性，增强miR-148a-3p表达。过表达DNMT1逆转CAS抑制HCC细胞干性特征的效应。转染miR-148a-3pmimic联合CAS协作性减弱HCC细胞干性特征。裸鼠移植瘤实验结果显示：单独的CAS或agomir-148a-3p抑制MHCC97H荷瘤裸鼠移植瘤生长，联合CAS和agomir-148a-3p的抑制作用增强。移植瘤组织的免疫组化染色显示：联合处理组的DNMT1和CD44蛋白表达比单独处理组更低。我们还发现：DNMT1活性以及DNMT1和CD44的mRNA水平在不同的处理组均有下降，但联合处理组的降低最显著，而且，随着DNMT1的减少，miR-148a-3p相应增加，另外，没有检测出DNMT3a和DNMT3b活性的显著变化。
综合以上结果，得出结论如下：
1.DNMT1和miR-148a-3p之间相互负性调控促进和维持HCC细胞干性特征是HCC发生和演进的重要病理机制之一。
2.通过中断DNMT1和miR-148a-3p之间相互负性调控抑制HCC细胞干性特征是CAS抗HCC的药理机制之一。