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研究背景脊髓损伤(spinal cord iniury,SCI)导致运动和感觉传导通路障碍,引起损伤以下部位部分或全部运动和感觉功能的丧失。其发病呈现两个明显的病理反应阶段,即以出血、水肿、细胞坏死以及伴随炎症性细胞因子、毒性自由基及蛋白酶释放引起的急性炎症反应为特征的初次损伤和以延迟性细胞死亡、脱髓鞘、慢性炎症反应及胶质疤痕形成为特征的继发性损伤。现有的治疗方法包括手术、药物和物理康复等,虽有一定疗效,但很难阻止病变发展。近年来,随着干细胞技术的发展,BMSCs移植治疗SCI已经取得了一定的疗效。国内外多数的动物实验和临床研究证实BMSCs移植治疗后,SCI导致的神经功能缺失症状能够得以明显改善。但对BMSCs移植后具体修复的机制缺乏深入的研究。有学者认为BMSCs可能通过分泌一些细胞因子抑制炎症反应从而减轻或阻止脊髓的继发损伤是一项重要的作用机制;研究证实BMSCs自身能够分泌白细胞介素-10,而白细胞介素-10是一种重要的细胞免疫反应的抑制剂,属抗炎性细胞因子;目前,国内外尚无关于骨髓间充质干细胞移植治疗小鼠脊髓损伤中白细胞介素-10作用的研究报道。本研究的目的主要是探讨骨髓间充质干细胞移植治疗小鼠脊髓损伤中白细胞介素-10的表达及影响;构建重组腺病毒AdCMV-mouseIL-10并转染BMSCs,研究IL-10-BMSCs移植对小鼠脊髓损伤后功能恢复的治疗作用;从而为脊髓损伤基因治疗的临床应用提供可靠的理论基础。研究目的1.利用免疫磁珠法从野生型及IL-10基因敲除型C57BL/6小鼠的骨髓细胞中分离纯化BMSCs,得到高纯度的BMSCs,为深入研究BMSCs创造条件。2.探讨骨髓间充质干细胞移植治疗小鼠脊髓损伤中白细胞介素-10的表达及影响。3.采用AdEasyTM-1 Vector System的构建流程方法构建重组腺病毒AdCMV-mouseIL-10,进行体外转染及观察重组腺病毒AdCMV-mouse IL-10对BMSCs增殖的影响。获得基因修饰的BMSCs,为基因治疗脊髓损伤的研究创造条件。4.探讨IL-10基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对小鼠脊髓损伤后功能恢复的影响。内容和方法1.采用免疫磁珠法从野生型及IL-10基因敲除型C57BL/6小鼠的骨髓细胞中分离纯化BMSCs、培养、传代。同时观察细胞生长特性,取第20代细胞,利用流式细胞仪检测表面标记物。2.将野生型小鼠BMSCs悬液(实验A组)及白细胞介素-10基因敲除小鼠BMSCs悬液(实验B组)在体外使用hoechst33342标记后分别注入小鼠脊髓损伤处并设对照组(注射PBS),术后以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定伤段脊髓组织IL-10及TNF-a mRNA的表达情况,并通过行为学观察及组织学检测了解脊髓的恢复情况;通过荧光显微镜观察冰冻切片,了解移植细胞的存活情况。3.利用RT-PCR的方法获得小鼠IL-10 cDNA;采用AdEasyTM-1 Vector System的构建流程方法构建重组腺病毒AdCMV-mouse IL-10;体外转染AdCMV-mouseIL-10并分别从DNA水平及蛋白水平检测转染后BMSCs细胞能否分泌mouseIL-10;研究感染后BMSCs的生长曲线,观察转染后对BMSCs增殖的影响。4.将携带IL-10基因的BMSCs(IL-10-BMSCs)移植于小鼠脊髓损伤处,术后以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定伤段脊髓组织IL-10及TNF-a mRNA的表达情况,并通过行为学观察及组织学检测研究脊髓的恢复情况。研究结果1.使用免疫磁珠法获得的小鼠BMSCs形态呈均一的成纤维细胞样,漩涡样生长:体外增殖迅速。流式细胞仪表面标记物检测第20代BMSCs细胞CD29、CD44二种细胞表面标志抗原均表达的阳性率达99%以上;2.移植术后第14、21、28天实验A组(注射野生型BMSCs组)IL-10的表达与实验B组(注射IL-10(-/-)BMSCs组)及对照组(注射PBS组)相比有统计学意义(P＜0.01);实验B组与对照组相比无明显统计学差异(P＞0.05);移植术后第3、9、14、21、28天TNF-a的表达实验A组与B组、对照组两两相比有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01):实验A组TNF-a的表达最低,其次为对照组,实验B组表达最高;实验A组行为学观察及组织学检测脊髓损伤的恢复效果明显优于实验B组与对照组,实验B组也优于对照组。移植术后14、28天标本冰冻切片的荧光显微镜可以观察到hoechst33342标记的BMSCs,某些细胞可在损伤脊髓中沿着矢状方向迁移至距原注射部位2～4mm远处。上述结果提示:BMSCs移植到损伤脊髓后可以存活,并且向周围迁移(本实验观察期为28天)。3.成功构建重组腺病毒AdCMV-mouse IL-10,体外转染BMSCs后,能够分泌IL-10且分泌的IL-10与转染剂量呈正相关;BMSCs增殖速度未见显著影响。4.移植术后第3、9、14、21、28天实验组(注射IL-10-BMSCs组)与对照组(注射野生型BMSCs组)IL-10、TNF-a的表达相比较有显著的统计学差异(P＜0.01),IL-10的表达明显高于对照组,而TNF-a的表达明显低于对照组;行为学观察及组织学检测脊髓损伤的恢复效果明显好于对照组。实验结论1.利用免疫磁珠法可以从野生型及IL-10基因敲除型C57BL/6小鼠的骨髓细胞中分离高度纯化的BMSCs,获得的细胞具有多分化潜能,符合干细胞的特性。2.BMSCs通过分泌内源性IL-10上调脊髓组织的IL-10的表达对脊髓损伤的修复起了重要的促进作用;为进一步研究BMSCs干细胞移植后具体的修复机制提供理论参考;同时,为后续的转基因治疗提供重要的理论依据。3.采用AdEasyTM-1 Vector System的构建流程方法可以成功构建重组腺病毒AdCMV-mouse IL-10;体外转染AdCMV-mouse IL-10后DNA水平及蛋白水平均有mouse IL-10的表达,且IL-10与转染剂量呈正相关;BMSCs增殖速度未见显著影响。4.利用白细胞介素-10基因修饰的BMSCs比单纯BMSCs移植的效果更好;通过外源基因转染的方法来增强BMSCs白细胞介素-10的表达是提高脊髓损伤治疗效果的一条崭新而可行的途径。