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目的:构建基于Eu荧光微球的时间分辨免疫层析试纸条,快速定量检测真菌毒素和IL-6,这两种指标可能作为真菌感染的潜在标志物,从而简便快速地诊断真菌感染,为临床提高诊断真菌感染效率提供新的思路和技术方法。方法:1.中药丸剂样本经过粉碎研磨后过筛,加入80%甲醇溶液采用溶剂提取法提取样本中的真菌毒素,分别用时间分辨免疫试纸条和ELISA平行检测5个稀释浓度的同种标本,对结果进行线性回归拟合处理。用时间分辨免疫试纸条对22种市售中药丸剂进行AFB1、DON和ZEN 3种真菌毒素含量的检测,分为清热解表、理气消食类、活血化瘀类、补虚类4组进行描述性分析。2.将调节好pH的70nm胶体金、活化好的EuNPs分别与鸡IgY和IL-6标记抗体(MIS02)偶联得到AuNPs-鸡IgY和AuNPs-MIS02复合物、EuNPs-鸡IgY和EuNPs-MIS02复合物,二者以一定比例混匀后均匀喷到结合垫上干燥,用稀释的羊抗鸡IgY抗体和IL-6包被抗体(MIS01)在NC膜的固定位置分别划上质控线(C线)和检测线(T线),37℃干燥处理。按照样品垫、结合垫、NC膜、吸水纸的顺序组装到PVC硬板上并装入试纸条卡壳内。样品直接加入加样孔,反应一定时间后用金标试纸阅读器、荧光分析仪检测,得到T/C比值,辅以标准曲线得到结果。重组IL-6抗原溶液经过Tris-HCl缓冲液稀释后用于对两种试纸条的线性及灵敏度、精密度、准确度和特异性等检测性能的评价,214份临床血清样本分为2组分别用胶体金试纸条和时间分辨试纸条进行检测,并与化学发光法结果进行线性回归拟合分析。3.统计方法:比对试验和线性评价均使用一元线性回归方法进行拟合分析,得到回归方程和拟合度;灵敏度计算根据线性方程用公式2*3 SD0/(?X2-?X0)得到;精密度采用批内和批间变异系数评价;正确度使用回收率评价;特异性则采用PCT、CRP和IL-8高值样本的检测结果评价。结果:1.时间分辨免疫试纸条和酶联免疫吸附法检测结果线性回归拟合具有高度相关性,AFB1:y=0.2718x+7.0017,n=5,R2=0.9925,(p<0.01);DON:y=0.3824x+26.447,n=5,R2=0.9955(p<0.01);ZEN:y=3.9444x-82.296,n=5,R2=0.9455(p<0.01)。22种市售中药丸剂有不同程度的AFB1、DON、ZEN污染,AFB1含量为1.029.94μg/kg,DON含量为100613.49μg/kg,ZEN含量为57.088398.43μg/kg。2.IL-6胶体金试纸条线性良好,线性范围为2200pg/mL,灵敏度为1.26 pg/mL,特异性良好,回收率在101102%之间,批内精密度CV和批间精密度CV分别为8.318.95%和9.1514.71%,与西门子全自动化学发光免疫分析仪结果一致性较好:y=0.9357x+7.2941(n=206,R2=0.8306,p<0.01);IL-6时间分辨试纸条线性良好,线性范围为2500 pg/mL,灵敏度为0.37 pg/mL,特异性良好,回收率介于102%至106%之间,批内精密度CV和批间精密度CV分别为5.92%8.87%和7.59%9.04%,与西门子全自动化学发光免疫分析仪结果一致性较好:y=0.9502 x+6.1397(n=214,R2=0.9520,p<0.01)。结论:1.时间分辨试纸条可用于快速检测中药丸剂中的AFB1、DON、ZEN含量,这3种真菌的毒素有可能成为真菌感染潜在的标志物,作为诊断真菌感染的指标之一。2.本研究建立了基于胶体金和Eu纳米微球的IL-6免疫层析检测方法,两种方法均具有简便、快速、低成本等特点,对比来看,基于Eu纳米微球的时间分辨免疫荧光法比胶体金法灵敏度和精密度更高,线性范围更宽,在临床血清标本比对试验中线性拟合效果也更好,说明基于Eu纳米微球的时间分辨免疫荧光试纸条性能优于胶体金试纸条。3.本研究探索性地建立了采用时间分辨试纸条检测真菌毒素与IL-6,联合检测可以提高真菌感染的诊断特异性和准确性,为临床快速诊断真菌感染提供了新的思路和技术方法。