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1目的:胰腺癌恶性程度高,预后差,多因早期转移导致死亡[1]。尽管对于胰腺癌致病过程中遗传方面和表观方面的改变已经有了更为深入的研究[2-6],但发病机制仍不明确,本实验拟行进一步探讨。Rab GTPase家族蛋白Rab14属于小G蛋白中RAS致癌基因亚家族中的一员。该家族蛋白参与调控囊泡运输,信号传导以及各类膜受体在细胞中的循环。Rab家族蛋白在肿瘤的发生和发展过程中参与调控细胞的增殖、侵袭、转化、凋亡等多种生命过程。Rab14已经被报道在多种肿瘤的发展过程中发挥作用,包括卵巢癌、口腔鳞癌、胃癌、肾细胞癌[7-9,11]。但是Rab14在胰腺癌中的表达模式以及临床意义还未见报道。在本次研究中,我们将分析胰腺癌中Rab14的表达模式及临床病理意义,探究Rab14是否可作为胰腺癌的分子标记物;其次,通过调控胰腺癌细胞中Rab14的表达水平,分析Rab14对胰腺癌细胞生物学行为产生的影响及分子生物学机制。2材料与方法2.1组织样本收集中国医科大学附属第一医院于2010-2014年间实施外科手术患者的胰腺癌组织标本103例,患者术前均未接受放化疗。肿瘤病理组织学分类和分化程度根据2017 WHO分类标准进行判定。2.2免疫组织化学样本组织经过包埋并制备样片、染色,对所有样本进行随机检测。2.3细胞培养Bxpc3以及Capan2细胞购买于美国典型培养物保藏中心（ATCC）。培养细胞所用的培养基基为RPMI-1640培养基,包含10%胎牛血清;培养条件为37℃,5%CO2。2.4细胞转染与干扰转染用Rab14质粒以及阴性对照空载质粒购买于Origene公司,转染试剂为lipo3000;干扰所用SMARTpool siRNA Rab14以及阴性对照Non-targeting siRNA购买于美国Dharmacon公司,干扰试剂为Dharmacon公司生产Dharmafect1reagent。2.5 Western blot收集培养的细胞,并提取细胞的总蛋白;接着采用Bradford法为样本总蛋白定量;将制备好的蛋白样品进行SDS-PAGE进行蛋白分离;转印于PVDF膜后进行抗体孵育;最后在进行发光并通过凝胶成像系统进行观察并保存。2.6实时荧光定量PCR用Trizol试剂提取样本总RNA;实时荧光定量PCR实验使用SYBR Green master mix试剂盒;PCR实验所用仪器为7500 Real-Time PCR System;内参基因为使用β-actin;目的基因的扩增倍数的测算方法依据2-ΔΔCt;本实验重复3次。2.7细胞增殖实验MTT实验:细胞过转染48小时,消化重悬细胞调整细胞密度;96孔板每孔接种100μl,约含1×103个细胞;每孔加入20μl MTT工作液培养4小时;490nm波长下测定各孔光吸收值,以不含细胞的等体积培养基作对照。2.8细胞侵袭转移实验基质胶侵袭实验:细胞悬液加入到transwell上室中,下室中加入含有15%的胎牛血清的1640培养基;孵箱中孵育16小时后,将未穿过基质胶的细胞用棉签擦去,将穿过基质胶的细胞用4%多聚甲醛进行固定;苏木精对细胞进行染色。2.9流式细胞术收集细胞并用PBS进行漂洗;用250μl缓冲液重悬细胞,并用多聚甲醛进行固定;加入5 mg/ml碘化丙啶及Annexin V/FITC,于暗室孵育15分钟;用流式细胞仪进行检测,分析细胞的凋亡水平;加入5 mg/ml碘化丙啶于暗室孵育15分钟,用流式细胞仪进行检测,分析细胞的周期水平。2.10统计分析所有的统计分析均使用SPSS 13.0软件。对Rab14表达和临床病理因素的关系用卡方检验;生存分析采用Kaplan-Meier法,用Log-rank检验判断差异性,其他处理组与对照组之间所得数据采用Student’s t检验方法进行分析。P<0.05为差异有意义。3结果3.1 Rab14在胰腺癌中的表达通过免疫组织化学方法检测了胰腺癌组织和癌旁胰腺组织中Rab14的蛋白表达情况,Rab14主要定位于细胞浆中,Rab14在胰腺癌组织中高表达。3.2 Rab14在胰腺癌中的临床病理意义Rab14在胰腺癌组织中的高表达水平与肿瘤较高的TNM分期,肿瘤组织学分级以及淋巴结转移显著相关。3.3 Rab14在胰腺癌细胞系中的表达分别选择Bxpc3细胞以及Capan2细胞分别进行Rab14转染以及干扰,并通过western blot方法检测转染以及干扰效率,结果显示转染Rab14后Bxpc3中Rab14表达量显著上调;而在Capan2细胞中,敲除Rab14后,Rab14的表达显著下调。3.4 Rab14促进胰腺癌细胞增殖将经过Rab14转染与干扰的胰腺癌细胞应用于MTT实验以及集落形成实验。MTT实验结果表明,Rab14过表达后,Bxpc3细胞增殖率提高;敲除Rab14后,Capan2细胞的增殖率降低。集落形成实验结果表明,Rab14过表达后,Bxpc3细胞形成的克隆数目增加;敲除Rab14后,Capan2细胞形成的克隆数目减少。3.5 Rab14促进胰腺癌细胞侵袭和转移将经过Rab14转染与干扰的胰腺癌细胞应用于基质胶侵袭实验。侵袭实验结果表明,Rab14过表达后穿膜细胞的数目增加,而Rab14表达缺失后穿膜细胞的数目减少。3.6 Rab14增强胰腺癌细胞的化疗抵抗性将经过Rab14转染以及干扰的胰腺癌细胞系用吉西他滨进行处理,通过流式细胞术检测细胞的凋亡水平发现,Rab14过表达后吉西他滨诱导的Bxpc3细胞凋亡水平降低;而Rab14表达缺失后吉西他滨诱导的Capan2细胞凋亡水平增加。3.7 Rab14调控细胞周期、侵袭、凋亡相关蛋白质的表达水平Rab14调控细胞中周期相关蛋白:Rab14过表达后Bxpc3细胞中cyclingA、cyclingD1、cyclingE、p-Rb、bcl-2表达量上调,p21表达量下调;Rab14表达缺失后,Capan2细胞中cyclingA、cyclingD1、cyclingE、p-Rb、bcl-2表达量下调,p21表达量上调。3.8 Rab14调控胰腺癌细胞中YAP/bcl-2通路活性水平Rab14过表达后Bxpc3细胞中YAP的表达量上调,Rab14表达缺失后Capan2细胞中YAP的表达量下调;Rab14通过促进YAP入核,并通过下游bcl-2抑制胰腺癌细胞凋亡。4结论Rab14在胰腺癌组织中表达量显著上调,并且与胰腺癌较高的TNM分期、肿瘤组织学分级、以及淋巴结转移显著相关。Rab14促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭、转移、细胞周期转化并增强胰腺癌细胞的化疗耐药性。Rab14调控胰腺癌细胞周期、侵袭、凋亡相关指标的表达,并激活胰腺癌细胞中YAP/bcl-2信号传导通路。