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岩藻聚糖硫酸酯主要存在于褐藻和某些海洋无脊椎动物中,是一种带负电荷的大分子水溶性硫酸杂多糖,主要成分为岩藻糖,具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗血栓、抗病毒和提高免疫力等药理活性,但要将其开发为口服的海洋创新药物,目前尚缺少有力的口服吸收机制和体内组织分布等方面的理论基础。这主要有两个原因:一通常认为大分子多糖很难经口服被机体吸收利用;二多糖复杂的分子结构使其检测尤其是生物样品中的检测存在一定困难。为解决上述问题,本课题拟用FITC标记不同分子量的岩藻聚糖硫酸酯,通过Caco-2细胞Transwell小室7天快速培养模型,研究不同分子量岩藻聚糖硫酸酯的吸收机制,并初步探讨岩藻聚糖硫酸酯在小鼠体内的组织分布,为岩藻聚糖硫酸酯的开发利用提供实验支持。具体包括以下几个方面:(1)FITC荧光标记高、低分子量岩藻聚糖硫酸酯用FITC分别对高分子量岩藻聚糖硫酸酷(HMWF)和低分子量岩藻聚糖硫酸酯(LMWF)进行荧光标记得其衍生物FITC-HMWF、FITC-LMWF,检测标记前后HMWF中岩藻糖含量分别为38.44%和41.56%,硫酸根含量分别为19.54%和20.97%;LMWF中岩藻糖含量分别为62.86%和67.11%,硫酸根含量分别为25.37%和25.33%;标记前后均无差异,可见岩藻糖含量和硫酸根基团并未受FITC荧光标记反应的影响;FITC-HMWF、FITC-LMWF琼脂糖电泳结果表明,FITC-HMWF、FITC-LMWF迁移速率和电泳条带有差异:FITC-LMWF迁移速率快于FITC-HMWF,电泳条带为均一的单条条带,与FITC-HMWF呈现的多条条带不同。以上结果可验证HMWF和LMWF标记成功。(2)网格蛋内吞参与岩藻聚糖硫酸酯的口服吸收调整Caco-2细胞密度和添加嘌呤霉素可以快速建立7天细胞吸收模型:Caco-2细胞以30X 104 cells/cm2的密度种植于含有0.4 μg/mL的嘌呤霉素不含双抗的DMEM培养基中,培养7天,其TEER值均大于500-Ω*cm2,不透过标志物荧光黄的表观渗透系数Papp<0.5*10-6 cm/S,结果均符合Caco-2细胞单层膜吸收模型标准,证明此模型完全可以用于口服药物吸收研究。在此模型中,通过研究不同分子量岩藻聚糖硫酸酯FITC-HMWF和FITC-LMWF吸收发现,FITC-HMWF和FITC-LMWF均可以被吸收,其中FITC-LMWF的Papp和吸收率更高且与浓度呈现负相关性,推测岩藻聚糖硫酸酯依赖于载体进行吸收转运;加入CPZ、NH4CL、Dynasore网格蛋白内吞抑制剂,发现三种抑制剂均能明显抑制FITC-LMWF吸收转运,抑制率分别为84.24%、74.61%、63.94%,推测网格蛋白内吞途径参与岩藻聚糖硫酸酯吸收转运。(3)岩藻聚糖硫酸酯的小鼠体内分布研究首先确定游离FITC经组织处理方法处理后不会干扰组织样品中FITC-LMWF的检测,然后以最高2500 mg/kg剂量对小鼠尾静脉注射FITC-LMWF验证了荧光标记岩藻聚糖硫酸酯的安全性。实验以50 mg/kg的剂量对小鼠进行尾静脉注射研究其体内组织分布发现,岩藻聚糖硫酸酯可快速分布于肾脏、肝脏、肺部和脾脏各组织,且优先向肾脏、肝脏聚集,0.5 h时肾脏、肝脏内药物浓度最大,分别为1092.31μg/g,284.27μg/g,远远高于其他组织;血液中在4 h后未检测出。推测岩藻聚糖硫酸酯进入血液后分布较快,其可以靶向分布于肾脏、肝脏等器官。综上所述,用FITC成功标记HMWF和LMWF,研究其口服吸收机制和组织分布发现,HMWF和LMWF均可以被口服吸收,其中LMWF吸收利用率更高,更容易被吸收;网格蛋白内吞抑制剂均能抑制LMWF的吸收,推测网格蛋白内吞参与岩藻聚糖硫酸酯的口服吸收转运;注射给药后岩藻聚糖硫酸酯组织可快速分布于体内大部分组织,且优先向肾脏肝脏积累,推测其可以靶向分布于肾脏、肝脏等器官。