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研究背景:缺血再灌注（ischemia reperfusion,I/R）损伤是临床常见的病理现象,可严重影响患者预后。远端缺血预处理（remote ischemic preconditioning,RIPC）是一种通过对远处单个或多个器官实施短暂缺血及再灌注预处理、通过神经和体液途径调控靶器官对I/R损伤耐受性的一种器官保护方法。肢体RIPC是目前最简单易行的RIPC方式之一,但其实现器官保护的最佳作用方式及在肝I/R损伤时的作用机制并不完全清楚,导致其临床应用受限。研究目的:本研究拟通过大鼠肝I/R损伤模型,评估不同下肢缺血预处理方式对肝保护的效果,明确最有效的肢体RIPC方式,并探究其对肝保护的可能机制,最后进一步验证肢体RIPC在老年大鼠中的肝保护效果。实验方法:1.单侧肢体RIPC肝保护方式的优化研究:将雄性SD大鼠,随机分为假手术（Sham）组,肝缺血再灌注（I/R）组,肝缺血预处理（ischemic preconditioning,IPC）组,肝缺血前即刻肢体远端缺血预处理（RIPC）组,肝缺血前6h肢体远端缺血预处理（RIPC’）组。采用大鼠经典70%肝热I/R模型（无损伤血管夹阻断肝左中叶血管,缺血60min后行再灌注）。其中,Sham组只开腹和分离血管,不给予夹闭缺血;I/R组行经典肝热I/R;IPC组于肝I/R前行10min肝缺血和10min再灌注;RIPC组分别于肝I/R前即刻于大鼠单侧下肢实施:（1）单次循环的10min缺血＆10min再灌注（RIPC-1×10）、（2）3个循环的10min缺血＆10min再灌注（RIPC-3×10）、（3）4个循环的5min缺血＆5min再灌注（RIPC-4×5）和（4）6个循环的4min缺血＆4min再灌注（RIPC-6×4）;RIPC’组则分别于肝I/R前6h实施RIPC组相同的操作。于肝再灌注2、6和24h取静脉血及肝组织标本,行组织和血清酶学评估,比较肝I/R时不同方式单侧肢体RIPC的肝保护作用,并明确其最佳肝保护方式。2.单侧与双侧肢体RIPC的保护效果差异及机制研究:将SD大鼠随机分为Sham组、I/R组、单侧下肢RIPC对照（c-RIPC）组、单侧下肢RIPC（RIPC）组和双侧下肢RIPC（D-RIPC）组。采用大鼠70%肝热I/R模型,于I/R前即刻,采用第一部分研究中确定的单侧肢体最佳RIPC方式对大鼠单侧或双侧下肢进行预处理,观察其对再灌注2、6和24h时肝细胞坏死、凋亡及血清酶学、组织环磷酸腺苷（c AMP）浓度、活性氧（ROS）水平及线粒体钙容纳力（CRC）的影响;并运用Western blot评估肝组织ERK1/2、p-ERK1/2、GSK-3β、p-GSK-3β等信号蛋白表达变化。3.单侧肢体RIPC对老年大鼠肝I/R损伤的保护作用研究:将老年SD大鼠随机分为Sham组,I/R组,IPC组、RIPC组,采用70%肝热I/R模型及单侧肢体最佳RIPC方式处理动物,于再灌注6h通过血清酶学和组织病理学评估肝损伤和凋亡情况、透射电镜观察RIPC对肝细胞超微结构的影响、ELISA法测定再灌注时肝组织炎症因子和氧化应激水平。4.统计分析:使用SPSS 20.0软件进行统计处理,使用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验,若数据非正态分布,实验结果以中位数（median）和四分间距（interquartile range,IQR）进行描述,并使用Mann-Whitney U检验进行比较;若数据呈正态分布,实验结果以均数±标准差（`x±S）表示,两组数据比较采用t-检验（Student’s t-test）分析其差异,多组数据之间比较采用方差分析（ANOVA）进行组间比较,采用Graphpad Prism 8.0软件作图。P＜0.05认为差异有统计学意义,P＜0.01认为差异有显著统计学意义。研究结果:1.单侧肢体RIPC肝保护方式的优化研究:（1）H-E和TUNEL染色结果显示:与Sham组相比,再灌注2、6和24 h I/R组的肝细胞坏死比例和凋亡细胞计数阳性百分比均显著升高;与I/R组相比,再灌注各时间点四种不同方式肢体RIPC组、RIPC’组的肝细胞坏死程度和凋亡细胞计数百分比均显著降低;与相同操作方式RIPC’组比较,再灌注各时间点RIPC组的肝细胞坏死和凋亡程度均显著降低,其中RIPC 4×5组（即4次循环5min缺血＆5min再灌注）的肝细胞坏死和凋亡比例最低。（2）血清酶学结果显示,与Sham组相比,再灌注2、6和24 h I/R组的血清ALT和AST水平均显著升高;与I/R组相比,再灌注各时间点四种不同方式RIPC和RIPC’组的血清ALT和AST均显著降低;与同方式的RIPC’组比较,RIPC组的血清ALT和AST均显著降低,其中RIPC 4×5组的血清ALT和AST水平最低。2.单侧与双侧肢体RIPC保护效果的差异及机制研究:与I/R组比较,再灌注2、6和24h RIPC及D-RIPC组在肝细胞坏死、凋亡及血清中ALT、AST和LDH水平方面均显著下降;与RIPC组比较,再灌注2h时D-RIPC组肝细胞坏死、凋亡及血清中ALT和AST水平均显著下降,但再灌注6和24h时两组上述指标无统计学差异（P＞0.05）。透射电镜观察肝细胞超微结构结果显示,与I/R组比较,RIPC和D-RIPC组肝细胞内质网和线粒体肿胀程度显著减轻,超微结构损伤降低。机制研究结果显示,与I/R组比较,RIPC和D-RIPC组肝组织CRC和c AMP浓度均显著升高、肝组织和血清TNF-α、IL-1β、ROS、MDA水平均显著下降,肝组织SOD和CAT水平升高。与I/R组比较,RIPC组肝组织Bax表达降低、Bcl-2表达升高、p-ERK和p-GSK-3β蛋白表达增加。3.单侧肢体RIPC对老年大鼠肝I/R损伤的保护作用研究:老年大鼠再灌注6h,与I/R组比较,RIPC组肝细胞坏死、凋亡及血清ALT和AST水平均显著降低;透射电镜结果显示RIPC组肝细胞线粒体和内质网肿胀较轻,能减轻肝细胞超微结构损伤;机制研究显示,与I/R组比较,RIPC组肝组织TNF-α和IL-1β基因表达均显著下降、IL-10表达增加、ROS和MDA水平下降、CREB表达升高。研究结论:1.大鼠70%肝热I/R损伤时,不同方式的单侧肢体RIPC可显著抑制肝细胞坏死和凋亡,减轻肝损伤,其中以单侧下肢缺血5min、再灌注5min、循环4次的RIPC操作方式保护作用最佳。2.单侧和双侧肢体RIPC均可通过抑制脏细胞炎症、氧化应激和线粒体损伤,减轻大鼠肝再灌注损伤。具体机制可能与肢体RIPC对c AMP-ERK1/2-BAX/BCL-2通路和c AMP-GSK-3β-MPTP轴调控相关;再灌注早期（2h）,双侧肢体RIPC较单侧具有更显著的肝保护作用,但再灌注中后期（6和24h）时两者无显著差异,进一步提示单侧肢体缺血5min、再灌注5min、循环4次的RIPC方式为减轻大鼠肝I/R损伤的最优化肢体RIPC方法。3.在老年大鼠中,单侧肢体缺血5min、再灌注5min、循环4次的RIPC方式能显著抑制I/R时肝细胞坏死和凋亡,其机制可能与肢体RIPC调控炎症因子、抗氧化应激及线粒体保护相关。