细胞的特性及其生物学行为与其所处的微环境之间存在重要的关系。肿瘤细胞的快速增殖及肿瘤血管的异常，常常导致实体肿瘤中呈缺氧状态，以往我们认为缺氧及缺氧诱导因子主要影响细胞的代谢和血管的重塑，但现在发现缺氧诱导因子在肿瘤的增殖、分化、侵袭转移产生重要的影响。此外，还发现缺氧诱导因子可以直接与一些细胞信号转导通路中的关键分子发生反应，如cMyc和P53。本文旨在探讨HIFs的亚基，HIF-1α与肿瘤之间的密切联系，进而深入研究其与肿瘤发生、发展的关系。　　 目的:分析HIF-1α，缺氧相关蛋白VEGF-a，GLUT-1在非特殊性浸润性乳腺癌中的表达情况，运用流行病学与统计学方法分析HIF-1α与乳腺癌临床病理学特点及预后的关系;明确HIF-1α的表达对乳腺癌细胞系生物学行为的影响，探索其中起主要作用的细胞信号转导通路;动物实验验证HIF-1α的表达对乳腺癌转移能力的影响。　　 方法:　　 1、采用免疫组化法检测HIF-1α、VEGF-a、GLUT-1在163例非特殊性浸润性乳腺癌中的表达情况，利用卡方检验分析HIF-1α的表达与乳腺癌临床病理特点的关系;采用K-M法及Logrank检验分析HIF-1α的表达与乳腺癌患者预后的关系;利用Kendall及Spearman非参数检验分析HIF-1α与VEGF-a和GLUT-1的表达水平的相关性;利用Cox多因素检验分析HIF-1α，VEGF-a，GLUT-1的表达与临床病理资料的危险因素关系。　　 2、在乳腺癌细胞系中直接低氧或者化学刺激的方式诱导缺氧，利用Western Blot方法检测低氧对乳腺癌细胞中HIF-1α表达的影响;利用MTT，Transwell方法检验HIF-1α表达对乳腺癌细胞系生长，侵袭能力的影响;利用Western Blot，共聚焦免疫荧光等方法检测HIF-1α表达对乳腺癌细胞系EMT状态的影响，全基因组表达芯片筛查HIF-1α诱导乳腺癌细胞EMT的分子通路;利用双荧光素酶报告基因，共聚焦免疫荧光等实验验证在缺氧状态下HIF-1α对NOTCH-1通路的激活情况。　　 3、动物实验利用裸鼠尾静脉注射正常或干扰HIF-1α表达的乳腺癌细胞，通过检测两组细胞在小鼠肺部形成转移瘤的能力考察HIF-1α表达对乳腺癌细胞系生长，侵袭能力的影响;利用免疫组化方法检测E-cadherin与NICD的表达，检验HIF-1α对乳腺癌细胞EMT状态的影响及对NOTCH-1通路激活的影响。　　 结果:　　 1、HIF-1α在乳腺癌组织中的表达与临床病理资料及预后的关系。　　 1.1、免疫组化共检测了HIF-1α在163例非特殊浸润性乳腺癌的表达情况，其中阴性表达94例(57.7％)弱阳性表达33例(20.2％)强阳性表达36例(22.1％)。HIF-1α的表达情况与乳腺癌TNM分期，分子分型，组织病理分型，复发情况密切相关。　　 1.2、对HIF-1α表达不同的三组病例行K-M生存分析，结果显示HIF-1α阴性表达病例预后好于阳性表达病例，Log-Rank检验P＜0.05。　　 1.3、免疫组化检测缺氧相关蛋白VEGF-a，GLUT-1在乳腺非特殊浸润性癌中的表达情况，其中VEGF-a表达阳性95例(58.3％)阴性68例(41.7％)，GLUT-1表达阳性126例(77.3％)阴性37例(22.7％)。相关性分析显示，在Kendall检验中，HIF-1α表达情况与VEGF-a表达情况呈正相关，相关系数为0.538，与GlUT-1表达情况呈负相关，相关系数为-0.31;在Spearman检验中，HIF-1α表达情况与VEGF-a表达情况呈显著正相关，相关系数为0.668，与GlUT-1表达情况呈负相关，相关系数为-0.4。Cox多因素分析显示，HIF-1α阳性表达、TNM分期、分子分型是影响乳腺癌预后的独立危险因素，相对危险度分别为1.41、4.56、3.47。　　 2、HIF-1α的表达对乳腺癌细胞系生物学行为的影响　　 2.1、对乳腺癌细胞系MCF-7及MBA-MD-231分别采用直接低氧刺激和化学刺激的方法诱导缺氧，24小时后HIF-1α蛋白表达上调，在MCF-7中，对缺氧刺激HIF-1α蛋白表达上调呈时间依赖性。在MCF-7中，分别转染Lentivirus-NC-FLAG和Lentivirus-HIF1αshRNA-FLAG，转染48小时后，两组细胞MCF-7-NC，MCF-7-HIF△分别予以缺氧诱导，MCF-7-NC细胞HIF-1α蛋白表达上调，MCF-7-HIF△细胞不表达HIF-1α。　　 2.2、分析HIF-1α蛋白表达上调对乳腺癌细胞系生物学行为的影响，利用MTT实验检测细胞的增殖能力，MCF-7-NC的增殖能力在缺氧12小时后开始明显减弱(P＜0.05)，缺氧对MCF-7-HIF△增殖能力无明显影响。利用Transwell实验检测细胞的侵袭能力，结果显示缺氧48小时后MCF-7-NC的侵袭能力明显增强(P＜0.05)，缺氧对MCF-7-HIF△侵袭能力无明显影响。　　 3、HIF-1α的表达对乳腺癌细胞系EMT状态的影响及相关通路的激活情况　　 3.1、缺氧48小时以后，MCF-7-NC可发生EMT，下调上皮标志物E-cad和Pan-CK，上调间质标志物α-SMA和FN; MCF-7-HIF△无明显EMT改变。共聚焦荧光染色显示:在缺氧和DFO作用下，MCF-7-NC细胞极性发生变化，呈长梭形改变，上皮标志物Pan-cytokeratin表达下调，间质标志物α-SMA表达上调;MCF-7-HIF△无明显EMT变化。　　 3.2、利用全基因组表达芯片筛选与细胞EMT关系最密切的Wnt、Notch、Sonic-Hedgehog(Shh)和TGF-smad通路发现，Notch通路相关基因及其调控基因表达上调明显。在缺氧情况下，MCF-7-NC发生Notch通路激活，Notch-1受体细胞膜内部分（NICD-1）表达上调，呈时间依赖性，略滞后于HIF-1α的上调。MCF-7-HIF△在缺氧条件下无法上调NICD-1的表达。在缺氧情况下，MCF-7-NC给予Notch-1受体抑制剂DAPT后NICD-1上调受抑制，E-cad表达无明显变化，说明EMT过程被阻断。MCF-7-HIF△无论是否给予DAPT均无法诱导EMT。MCF-7-NC转染Luc-Notch1 Promoter-HRE24小时后，报告基因显示，Notch-1表达荧光强度上升30％以上(P＜0.05)，而转染Luc-Notch1 Promoter-non HRE24小时后Notch-1荧光强度无明显变化;MCF-7-HIF△转染前述两种报告基因均不能增加Notch-1表达。荧光共聚焦显示，在缺氧情况下，MCF-7-NC发生Notch通路激活，Notch-1受体细胞膜内部分（NICD-1）表达上调。MCF-7-HIF△在缺氧条件下无法上调NICD-1的表达。　　 4、动物实验，注射MCF-7-NC组裸鼠肺部转移成瘤13例，注射MCF-7-HIF△组裸鼠肺部转移成瘤9例，注射MCF-7-NC组成瘤率显著高于注射MCF-7-HIF△组;临床症状:MCF-7-NC组胸水出现3例，MCF-7-HIF△组0，MCF-7-NC组显著高于MCF-7-HIF△组;肺内成瘤数MCF-7-NC组平均成瘤数22.4±4.1，MCF-7-HIF△组13.8±3.2，MCF-7-NC组显著高于MCF-7-HIF△组。肺最大转移瘤平均直径MCF-7-NC组3.2mm，MCF-7-HIF△组2.5mm，MCF-7-NC组显著高于MCF-7-HIF△组。　　 结论:　　 1、HIF-1α广泛表达于乳腺癌组织中，其表达影响乳腺癌的生物学行为。　　 2、HIF-1α高表达是影响乳腺癌预后的独立危险因素。　　 3、HIF-1α与某些缺氧相关蛋白的表达呈正相关，参与了缺氧调控的乳腺癌微环境改变。　　 4、在体外条件下，诱导乳腺癌细胞系MFC-7缺氧可以上调HIF-1α的表达，干扰HIF-1α的表达后，MFC-7对缺氧刺激无应答。　　 5、上调HIF-1α的表达，可以诱导乳腺癌细胞MFC-7发生EMT，其增殖能力减弱，细胞的迁移，侵袭能力增强。　　 6、HIF-1α诱导乳腺癌细胞MFC-7发生EMT是通过激活NOTCH-1通路实现的，干预NOTCH-1通路的激活可以抑制细胞发生EMT，消除由MFC-7 EMT导致的细胞生物学行为的变化。　　 7、动物实验实验结果显示，干预HIF-1α的表达，可以显著减低乳腺癌细胞系MFC-7的转移能力，在敲除HIF-1α表达的肺转移灶中NOTCH通路的激活情况受到抑制，EMT程度减轻。