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长期以来高尿酸血症（Hyperuricemia HUA）仅仅被认为是代谢异常的一种标志,临床上高尿酸血症患者多伴有肾脏病、高血压、心血管疾病、糖尿病等疾病出现。虽然对于高尿酸血症在这些疾病中是一个病因抑或仅仅是一个“标志”存在争论，但更多证据表明，高尿酸血症本身对肾脏和心血管系统有直接损伤作用，是肾脏疾病和心血管疾病的独立危险因素。尿酸或尿酸盐引起肾脏损伤除了尿酸盐结晶导致的梗阻外，尿酸致肾脏病机制主要包括肾小球入球小动脉微血管病变、肾脏炎症反应以及激活肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）、活化环氧酶-2（cyclooxygenase2,COX-2）。尿酸结晶还可以激活补体系统，启动炎症反应，刺激肾小管上皮细胞合成前列腺素E2(PGE2)和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），使局部炎症反应放大，最终导致肾间质纤维化，甚至肾衰竭。众所周知，细胞与细胞之间的联系通过一些连接装置实现，包括紧密连接（Tight junction，TJ）、粘附连接（Adherens junction，AJ）、缝隙连接（Gapjunction）、桥粒连接（Desmosome junction）。其中紧密连接（TJ）是指上皮细胞顶端侧面质膜中的密封蛋白和封闭蛋白在细胞间构成的密封连接，对于维持表皮和内皮细胞的选择渗透性屏障功能起关键作用。紧密连接是一动态调节结构，由跨膜蛋白（occludin、claudins）和膜周蛋白（ZO-1，ZO-2，ZO-3）组成。TJ除机械连接作用外，还有两个主要功能：一是“门（gate）”功能，封闭细胞顶部的细胞间隙，隔绝机体内外环境；隔绝机体局部内环境，控制细胞旁路的物质转运。二是“藩篱（fence）”功能，维持细胞极性；调控细胞增殖和分化；参与上皮细胞EMT过程。多种因素如氧化应激、病原体、促炎症细胞因子等均可破坏紧密连接蛋白结构及功能，紧密连接的破坏涉及多种疾病，包括胃肠道、肺及肾脏疾病等。Paleerath等提出草酸钙结晶可破坏紧密连接屏障功能及藩篱功能，一定程度上提出了TJ在肾结石引起肾间质纤维化中的作用。但目前研究来看，尿酸性结石与紧密连接蛋白及肾间质纤维化的关系仍未明确，有待进一步研究。一：研究目的1．探讨尿酸钠结晶（MSU）对肾小管上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达、分布及功能的影响；2．探讨尿酸钠结晶对肾小管上皮细胞转分化的影响。二：方法无血清培养基同步化NRK-52E细胞24小时后，加MSU刺激细胞：1．MTT法观察MSU（100μg/ml，300μg/ml，500μg/ml，700μg/ml）刺激NRK-52E细胞24h，及MSU500μg/ml刺激NRK-52E细胞24h、48h、72h，细胞活性的变化；2．倒置相差显微镜下观察MSU对NRK-52E细胞形态改变的影响；3．免疫荧光法检测ZO-1、E-cad、α-SMA的分布及表达；4．RT-PCR法检测ZO-1mRNA、Occludin mRNA、E-cad mRNA、α-SMA mRNA的表达。三：结果1．MTT检测MSU对细胞活力的影响1.1．不同浓度MSU（100μg/ml，300μg/ml，500μg/ml，700μg/ml）刺激NRK-52E细胞24h，细胞活性分别下降至正常对照组的89.13±7.7%；85.60±12%；78.54±13%；47.82±14%，（P<0.05）；1.2．MSU（500μg/ml）刺激NRK-52E细胞24h、48h、72h，细胞活性分别降至正常对照组的69.79±8.34%；66.43±10.15%；65.73±10.05%，（p<0.05）。2．MSU对细胞形态改变的影响倒置相差显微镜下观察不同时相，MSU（500μg/ml）刺激NRK-52E细胞引起的细胞形态变化：2.1、空白对照组NRK-52E细胞在培养板中呈圆形或卵圆形，具有典型的上皮细胞铺路石样形态学特征，各时相细胞形态无明显改变。2.2、与空白对照组相比，MSU诱导NRK-52E细胞24h后，细胞形态未见明显改变；培养48h后，细胞肥大，逐渐失去典型的铺路石样形态；培养72h后，细胞变长呈梭形，失去铺路石样外观，具有成纤维细胞特性。3．间接免疫荧光检测MSU对ZO-1、E-cad、α-SMA蛋白表达及分布情况紧密连接蛋白（ZO-1）及E钙黏素蛋白（E-cad）主要在细胞膜表达；a平滑肌肌动蛋白（α-SMA）以胞浆表达为主，正常细胞表达量少，甚至不表达。MSU（500μg/ml）刺激NRK-52E细胞24h、48h、72h，免疫荧光显示ZO-1、E-cad荧光强度下降，随着MSU作用时间的增加，ZO-1、E-cad的荧光强度逐渐下降，且细胞膜蛋白出现断裂分布现象，以72h作用明显；MSU（500μg/ml）刺激NRK-52E细胞24h、48h、72h，免疫荧光显示随着MSU作用时间增加，α-SMA荧光表达逐渐增强。4. RT-PCR检测MSU对NRK52E细胞ZO-1mRNA、Occludin mRNA、E-cadmRNA、α-SMA mRNA表达的影响正常NRK-52E细胞可表达较为丰富的ZO-1mRNA、Occludin mRNA、E-cadmRNA或表达少量α-SMA mRNA。与正常对照组相比，MSU（500μg/ml）刺激NRK-52E细胞24h、48h、72h时，ZO-1、Occludin和E-cad mRNA表达降低（p<0.05）,72h下降明显（p<0.01）；而α-SMA mRNA表达量各时相均高于正常对照组（P<0.05）,72h时升高明显（p<0.01）。结论：1．尿酸钠晶体（MSU）作用于肾小管上皮细胞，可导致紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin）表达降低、分布异常及细胞与细胞间连接功能破坏。2．MSU诱导NRK-52E细胞紧密连接蛋白表达降低的同时伴有E-cad表达下降、α-SMA表达增强，提示紧密连接结构的破坏可能是尿酸晶体启动肾小管上皮细胞损害及转分化重要环节之一。