背景:幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori,HP）是一种具有鞭毛的革兰氏阴性菌,与消化道溃疡及胃癌的发生具有一定的相关性。有文献报道,超过80%左右的胃溃疡由HP感染所致,并被WHO列为胃癌的第一大危险因子。现阶段临床针对HP感染的治疗,主要是“三联疗法”和“四联疗法”,仅能依靠医生的经验以及院内的抗生素用药偏好。因各地区流行的菌株耐药情况不同,容易造成一次治疗根除率不高,浪费医疗资源。因此,迫切需要对患者体内感染的菌株进行耐药性实验,为抗生素的选择提供指导,实现精准治疗。经典检测HP耐药性的药敏试验以及Sanger测序法操作步骤繁琐、失败率高,不利于临床上推广应用。本研究拟建立一种基于多重实时荧光PCR的快速检测HP耐药基因方法,通过多角度优化,达到准确性高、操作便捷、检测时间短的目标,为临床幽门螺旋杆菌的治疗提供有效的辅助指导。研究目的:本研究针对HP的Ure A脲酶基因设计快速检测HP的特异荧光PCR方法,同时设计多重荧光PCR方法检测HP的耐药基因,通过与传统药敏试验和Sanger测序法进行对比分析,探讨其准确性与高效性,以建立快速、准确检测HP耐药基因位点的新方法体系。研究方法:1.针对HP-Ure A脲酶基因设计引物探针,摸索最优引物浓度、反应体积及退火温度,建立HP-Ure A脲酶基因定性检测体系;2.利用免疫组织化学法与HP-Ure A脲酶基因定性检测体系,分别检测来自福建省立医院的232例幽门螺旋杆菌阳性的石蜡包埋胃黏膜组织切片样本,对比分析结果后,确立PCR扩增体系及阳性参考值范围;3.对随机入组的从北京地区获得85例临床幽门螺旋杆菌感染患者的耐药的样本进行测序,分析测序结果,根据测序位点和序列建立多重荧光PCR检测HP耐药突变位点体系;4.通过与传统药敏试验及Sanger测序法进行对比分析,评价多重荧光PCR检测HP耐药突变位点体系的特异性、灵敏度;5.对北京地区随机入组的285例临床样本,应用多重荧光PCR-HP耐药突变位点体系进行检测,并与Sanger测序法和药敏实验法同步进行对比,分析三种方法检测的一致性。研究结果:1.建立了HP-Ure A脲酶基因核酸检测体系,灵敏度可达到1.0×10~2copies/m L;2.利用免疫组织化学检测112例已知HP阳性的样本,得到结果是染色强度为+有27例、++有38例、+++有47例;利用本研究的HP-Ure A检测体系检测后,32≤Ct＜38有27例、24＜Ct＜32有38例,Ct≤24有47例,与免疫组化强度结果相关（Kappa值为1）,将Ct值＜38定为本PCR检测方法的阳性参考值范围。3.进一步对120例样本应用HP-Ure A脲酶基因核酸检测体系进行验证,与免疫组化结果对比分析,Kappa值为0.962,二者高度相关,且荧光PCR检测Ct值范围与临床幽门螺旋杆菌不同程度感染情况一致;4.对85例耐药的样本进行测序,结果显示23S r RNA、PBP1、Gyr A和6S r RNA基因共存在11种突变,根据突变比例及多重荧光通道限制,选择其中10种基因突变为靶点进行下一步耐药PCR检测体系建立;5.针对克拉霉素4个位点、阿莫西林2个位点、左氧氟沙星3个位点及四环素连续三个碱基变化分别建立了单管检测体系,不同位点以探针荧光标记不同区分,找到最优引物用量、最优的反应体积25μL,最优的退火温度为60℃,灵敏度均可达1.0×10~2copies/m L,成功建立多重荧光PCR-HP耐药突变位点检测体系;6.对多重荧光PCR HP耐药突变位点体系性能进行分析,发现特异性为100%,灵敏度达1.0×10~2copies/m L,重复性CV值＜5%;7.对285例临床临床样本进行检测,发现多重荧光PCR法与Sanger测序法的Kappa值为0.998,为高度相关;与药敏试验法的Kappa值为0.935,也为高度相关,可以确定多重荧光PCR方法检测结果与传统药敏试验可信度一致。多重荧光PCR法从获得样本到完成检测仅需4小时,而常用的药敏试验全流程需要5～7天,sanger测序法的检测周期为5天,PCR方法更为简便、快捷。研究结论:1.本研究建立HP脲酶基因荧光PCR检测法,检测效果与免疫组化法相当,可与HP耐药基因突变多重荧光PCR方法形成配套,一起应用于HP耐药监测;2.本研究建立的幽门螺旋杆菌耐药基因突变多重荧光PCR方法,其具备更高的检测灵敏度和准确性,与传统药敏检测方法等效果一致,但操作更为简便快捷,可为临床应用带来便利。