水稻的C光合基因工程及其生理基础

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高等植物在光合类型上可分为C3、C4、CAM三大类。C4和CAM植物是在逆境条件下经过长期驯化,从C3植物进化而来的。与C3植物相比,C4植物由于具有CO2浓缩机制,能在高光强、高温及低浓度CO2、干旱等条件下,比C3植物有较高的光合速率和营养、水分利用效率。然而遗憾的是,许多重要的粮食作物(例如水稻)都是光合效率较低的C3植物。从生理上分析,我国现有的高产水稻品种的光能利用率仅为1%~1.5%,与理想的光能利用率3%~5%相比,尚有很大的潜力可挖。人们受到C4光合途径的启发,希望通过转基因技术改造水稻等C3植物,以增强其叶片的光合能力,从而达到提高光合效率和产量的目的。改善C3作物光合作用的内在遗传基础,提高光合效率,已成为分子育种新兴学科的重要研究领域。
   二十世纪末,随着转基因技术的快速发展,以农杆菌为介导己成功地将来自玉米编码C4光合途径关键酶PEPC、PPDK和NADP-ME的基因分别转入水稻中,获得了不同的高表达的转基因水稻材料。本文以转C4基因的水稻为材料,进行了系列研究,得到以下结论:
   1.利用冻融法,使用不同的CaCl2浓度对不同细胞生长状态的农杆菌进行重组质粒导入的研究,以确定最适的导入条件。结果表明,菌体OD600值和不同的CaCl2浓度对转化有不同程度的影响。在OD600值为0.4时,液氮条件下用浓度为50mmol.L-1的CaCl2溶液对菌体进行处理得到的转化率最高。实验得到转化子,并进行了菌落PCR技术的鉴定。
   2.以杂交水稻的亲本籼稻不育系2364S为材料,建立了农杆菌转化的体系,以期获得转PEPC基因的籼稻亲本,为杂种优势利用和生理育种的结合提供依据。
   3.进一步用杂交的方法获得转PEPC+PPDK双基因水稻,测定了环境因素对其光合生理指标的影响,发现转PEPC+PPDK基因水稻显著地增加了光合能力。进一步研究转PEPC+PPDK基因水稻的光合保护能力,看到玉米PEPC和PPDK基因导入水稻后,在高光强下光合速率提高50%,光合作用的光抑制减轻。在高光高温自然条件下转PEPC+PPDK基因水稻中午Fv/Fm降低较少,光抑制较轻,光能转化为化学能的效率较高,热耗散较低。在中度干旱处理后,转PEPC+PPDK基因水稻表现出净光合速率和蒸腾速率高,气孔导度增加,胞间CO2浓度降低的特性。
   4.以原种和转PEPC+PPDK双基因水稻为材料,进行了PCR检测,C4光合酶活性的测定。通过ATP处理后,分析了光、温-光合曲线和活性氧代谢有关指标,统计分析了相关的产量构成因素。原种中虽有全套的C4光合酶,但活性很低。PCR检测出玉米的PEPC和PPDK基因转入普通水稻后,转PEPC+PPDK双基因水稻高表达了C4光合酶。在高光和高温条件下,同未施ATP的相比,ATP处理后转PEPC+PPDK双基因水稻光合速率提高17%,在光氧化条件下,耐光氧化能力进一步增强,产量提高15%。ATP处理后,转PEPC+PPDK基因水稻增强了光合生产力,表明ATP是设计类似C4水稻的关键因子。
   5、测定了不同转C4光合酶基因水稻的C4光合酶活性、光合速率以及活性氧代谢有关指标,发现原种中具有全套的C4光合酶,但活性很低,而不同转C4光合酶基因水稻高表达了相应的C4酶活性。转PPDK、PEPC光合酶基因水稻的饱和光合速率比原种高,其中转PEPC和转PEPC+PPDK双基因水稻的光饱和点比原种高200μmol m-2 s-1,而转PPDK、ME基因水稻的光饱和点与原种相差不大。在高光条件下,与原种相比较,转PPDK基因水稻的光合速率未增加,转ME基因水稻的光合速率降低了7.6%,转PEPC基因水稻的光合速率增加了52.1%,转PEPC+PPDK双基因水稻与转PEPC基因水稻相近。ATP处理后,可显著提高转PEPC+PPDK双基因水稻的光合放氧速率,显现出类似C4的光合特点,表明ATP是构建C4水稻的关键因子。光氧化条件下,转PEPC+PPDK基因水稻的耐光氧化能力得到进一步的增强。
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