论文部分内容阅读
巨噬细胞、树突状细胞是构成机体免疫系统的关键部分,是抵御病原体入侵、维持机体健康稳态的主要细胞之一。巨噬细胞是机体炎症反应和先天性免疫反应中关键的效应细胞和调节细胞;树突状细胞启动并调节高度病原特应性的适应性免疫反应,也是产生免疫记忆和免疫耐受的关键。巨噬细胞以及树突状细胞与多种疾病的发生、发展息息相关。如肿瘤相关巨噬细胞可以分泌多种细胞因子等促进肿瘤发展、转移;Ⅱ型糖尿病脂肪组织中募集的巨噬细胞分泌炎性细胞因子,导致胰岛素抵抗;树突状细胞提呈自身抗原时,激活自身反应性淋巴细胞,导致机体免疫失衡,导致自身免疫疾病发生。干预这两种细胞的功能,将有助于疾病的治疗。本论文基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,利用阳离子脂质辅助的PEG-b-PLGA聚合物纳米颗粒(CLAN)载药体系,制备包载CRISPR/Cas9核酸药物,分别靶向巨噬细胞和树突状细胞,研究其对巨噬细胞和树突状细胞功能的干预,以及对于相关疾病治疗的效果。本论文的研究工作主要分为两部分:1.CRISPR/Cas9基因编辑工具有望用于治疗多种疾病,我们构建了巨噬细胞特异性启动子启动的Cas9质粒系统,并且利用CLAN技术包载该质粒。在体内、体外,均实现了在巨噬细胞及其前体单核细胞中特异性Cas9蛋白表达。进一步将靶向Ntn1的gRNA(sgNtn1)构入质粒中,在体内巨噬细胞及其前体单核细胞中敲除Ntn1,减低netrin-1(Ntn1编码蛋白)表达,可显著改善Ⅱ型糖尿病的症状。与此同时,由于CD68启动子特异性启动Cas9的表达,在其它细胞中基本没有Ntn1基因的敲除。这种策略为实现纳米载体系统高效介导体内CRISPR/Cas9系统特异性基因编辑提供了新的途径。2.重建免疫耐受是治疗自身免疫疾病的关键,而树突状细胞是诱导抗原特异性免疫耐受的重要细胞。我们利用CLANpCas9/gCD80,86,40/2.5mi成功递送靶向共刺激分子的CRISPR/Cas9系统,及自身免疫疾病Ⅰ型糖尿病相关抗原肽(2.5mi)至树突状细胞。敲低树突状细胞共刺激分子的同时提呈疾病相关抗原肽,诱导抗原特异性调节性T细胞,抑制Ⅰ型糖尿病模型鼠的发病并且恢复其正常血糖。这一策略为干预树突状细胞功能提供了新的方法,为Ⅰ型糖尿病的治疗提供了重要参考。