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研究背景食管癌是当今世界上严重危害人类生命与健康的恶性肿瘤之一,我国的食管癌的发病率高居世界首位,尤其是在太行山脉附近的省份明显高发。淋巴道转移是食管癌早期转移的重要途径,同时也是恶性肿瘤术后转移复发的主要原因。淋巴管内皮细胞作为淋巴管最基本的单元,是食管癌淋巴道转移的重要界面。不同分化程度的食管癌的转移力和侵袭力是不同的,促进其相关淋巴管的生成能力也是不同的。淋巴管内皮细胞的调控因子有多种,其中血管内皮生长因子VEGF-C是目前公认的淋巴管生成的主要调控因子,可以与淋巴管内皮细胞表面的VEGFR-3结合,诱导VEGFR-3发生酪氨酸激酶磷酸化,促进恶性肿瘤内淋巴管生成,从而导致肿瘤细胞侵入周围淋巴结及远处扩散。而Endostatin是一种很强的血管生成抑制因子,能够抑制淋巴管生长因子VEGF-C的作用,在体外强烈的抑制淋巴管内皮细胞的增殖和游走,并明显地抑制肿瘤的生长和转移,还可以诱导淋巴管内皮细胞的凋亡,从而抑制了肿瘤的淋巴道转移。本课题采用不同分化程度的食管鳞癌细胞的培养上清液三维培养食管鳞癌相关淋巴管内皮细胞,观察其对食管鳞癌相关淋巴管内皮细胞增殖及成环能力的影响；构建针对VEGF-C的慢病毒载体或pSINsi-U6-siRNA真核表达载体及应用endostatin分别处理不同分化程度的食管鳞癌细胞后,取其培养上清液再处理食管鳞癌相关淋巴管内皮细胞,观察对食管鳞癌相关淋巴管内皮细胞体外成环能力及增殖的影响,探讨肿瘤源性微淋巴管内皮细胞与食管鳞癌细胞间的相互作用及其可能机制,为进一步探讨食管癌淋巴道转移机制及其阻断研究提供理论依据。目的研究不同分化程度的食管鳞癌细胞系细胞对肿瘤微淋巴管内皮细胞体外成环及增殖的影响；研究VEGF-CsiRNA真核表达载体及endostatin对食管鳞癌相关淋巴管内皮细胞体外成管能力及增殖的影响。方法1.采用免疫细胞化学及Western Blot方法检测食管癌相关淋巴管内皮细胞中VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin.Prox-1蛋白的表达；采用原位杂交方法检测食管癌相关淋巴管内皮细胞VEGFR-3、LYVE-1、 Podoplanin. Prox-1mRNA的表达；2.培养高分化食管鳞癌EC9706细胞及低分化食管鳞癌KYSE150细胞,收集其无血清培养基上清,作为食管癌相关淋巴管内皮细胞的条件培养基；分组三维培养食管癌相关微淋巴管内皮细胞：E1组加入EC9706条件培养基,E2组加入KYSE150条件培养基,K组不更换培养基。计数三组细胞形成的管样结构。消化各组细胞,采用CCK-8方法检测细胞增殖情况。3.构建慢病毒载体和真核表达载体,进行侵／转染效率评价,选择最优方式。针对人源VEGF-C设计3条干扰序列SG0SG1、SG2,并筛选出最佳干扰序列。4.内皮素抑制试验：用不同浓度的endostatin处理EC9706细胞和KYSE150细胞,采用CCK-8方法选取最佳抑制浓度。5.将EC9706细胞和KYSE150细胞进行细胞转染和endostatin处理,并制备条件培养基。分组如下：空白对照组：未转染的食管癌细胞的条件培养基。阴性对照组：转染阴性质粒的食管癌细胞的条件培养基。SG1组：转染SGl质粒的食管癌细胞的条件培养基。SG2组：转染SG2质粒的食管癌细胞的条件培养基。内皮抑素组：最佳浓度内皮抑素处理的食管癌细胞的条件培养基。阴性+内皮抑素组：转染空质粒后又经最佳浓度内皮抑素处理的食管癌细胞的条件培养基。SG1+内抑皮素组：转染SG1后又经最佳浓度内皮抑素处理的食管癌细胞的条件培养基。SG2+内抑皮素组：转染SG2后又经最佳浓度内皮抑素处理的食管癌细胞的条件培养基6.按照上述分组三维培养食管癌相关微淋巴管内皮细胞并计数各组细胞形成的管样结构。消化各组细胞,运用CCK-8方法检测细胞增殖情况。7.统计学处理：应用SPSS17.0软件处理,计量资料进行单因素方差分析,多组均数间的两两比较采用LSD-t法,检验水准a=0.05。结果1.免疫细胞化学、Western Blot及原位杂交检查结果显示：VEGFR-3. LYVE-1、Podoplanin、Prox-1蛋白及mRNA在食管癌相关淋巴管内皮细胞中均有表达。2.三维培养结果显示：在每一个时间点上,食管癌相关淋巴管内皮细胞成环的数目E1组>E2组>K组,差异有统计学意义(P均<0.05)；随着时间的延长,E1组和E2组的成环数均有不同程度的减少。3.CCK-8法检测结果：三组细胞的增值情况为E1组>E2组>K组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.侵／转染效率评价结果：KYSE150细胞侵染效率为90%以上,转染效率为70%左右,可以进行下游实验；EC9706细胞侵染效率约为30%左右,转染效率约为50%左右,达不到下游实验要求。在此,选择质粒转染进行后续试验。5.质粒筛选结果：转染后,EC9706和KYSE150细胞中SGl和SG2中VEGF-C蛋白的表达量明显低于其他各组,即SG1和SG2的抑制效果均优于其他组。6.三维培养结果：6.1EC9706细胞收取条件培养基进行三维培养的各组细胞的成环结果中,空白对照组>阴性对照组>内皮抑素组>阴性+内皮抑素组>SG2组>SG1组>SG2+内皮抑素组>SG1+内皮抑素组,其中两对照组之间比较,SG1+内皮抑素组和SG2+内皮抑素组比较差异没有统计学意义(P>0.05),SG1组、SG2组、内皮抑素组、阴性+内皮抑素组分别两两比较差异没有统计学意义(P>0.05)。余各组两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。6.2KYSE150细胞收取条件培养基进行三维培养的各组细胞的成环结果中,总体上比较,阴性对照组>空白对照组>NC+内皮抑素组>内皮抑素组>SG2组>SG1组>SG1+内皮抑素组>SG2+内皮抑素组,其中两对照组之间比较,SG1+内皮抑素组和SG2+内皮抑素组比较差异没有统计学意义(P>0.05)；SG1组、SG2组、内皮抑素组、NC+内皮抑素组分别两两比较差异没有统计学意义(P>0.05)；余各组两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。6.3将EC9706细胞收取条件培养基进行三维培养的各组和KYSE150细胞收取条件培养基进行三维培养的各组进行比较,经过处理后的KYSE150细胞的条件培养基培养的食管癌相关淋巴管内皮细胞的成环数高于EC9706细胞的条件培养基。7.CCK-8结果：7.1在EC9706细胞收取的条件培养基进行三维培养后各组细胞的增殖情况中,各组活细胞数空白对照组>阴性对照组>内皮抑素组>阴性+内皮抑素组>SG2组>SG1组>SG1+内皮抑素组>SG2+内皮抑素组,SG2组和内皮抑素组比较,SG2组和阴性+内皮抑素组比较,内皮抑素组和阴性+内皮抑素组比较,SG1+内皮抑素组和SG2+内皮抑素组比较,差异没有统计学意义(P>0.05)。余各组进行比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。7.2在KYSE150细胞收取的条件培养基进行三维培养后各组细胞的增殖情况中,各组活细胞数空白对照组>阴性对照组>内皮抑素组>SG2组>SG1组>阴性+内皮抑素组>SG1+内皮抑素组>SG2+内皮抑素组,两对照组比较,SG1组和SG2组比较,SG1组和内皮抑素组比较,SG1组和阴性+内皮抑素组比较,SG2组和内皮抑素组比较,SG2组和阴性+内皮抑素组比较,,SG1+内皮抑素组和SG2+内皮抑素组比较,差异没有统计学意义(P>0.05)。余各组进行比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。7.3将EC9706细胞收取条件培养基进行三维培养的各组和KYSE150细胞收取条件培养基进行三维培养的各组进行比较,经过处理后的KYSE150细胞的条件培养基培养的食管癌相关淋巴管内皮细胞的增殖量高于EC9706细胞的条件培养基。结论1、不同分化程度的食管癌细胞均可促进食管癌微淋巴管内皮细胞的体外成环及增殖能力,低分化食管癌细胞效应更为明显。2、VEGF-C siRNA及endostatin均可抑制食管癌相关淋巴管内皮细胞成环及增殖能力。