背景:胆囊作为构成胆道系统的重要部分,主要用于浓缩储存胆汁和排出胆汁。而慢性结石性胆囊炎属于胆道动力功能减弱性疾病。随着Hinescu ME[1]首次发现Cajal间质细胞(ICC)在胆道中存在后,也为今后研究胆道动力发生机制提供了一个指引方向。ICC在胃肠道上的发现及其作用机制的研究进展比在胆道动力上要更加深入。根据研究表明,ICC是胃肠道的起搏细胞[2],调节胃肠平滑肌的节律,也是胃肠正常运动的基础条件。缝隙连接蛋白43、45(Connexin43、45,Cx43、Cx45)是构成细胞间缝隙连接(GJ)通道的基本结构和功能的一大类膜蛋白中分布相对较广泛的两种蛋白[3]。而GJ是相邻细胞间进行小分子物质及电化学信号传递的特殊通道,具有调节相邻细胞的协同反应。随着ICC-SMC网络研究的进展,已有相关研究表明Cx43、Cx45存在于胃肠Cajal间质细胞(ICC)与平滑肌细胞(SMC)之间[1],通过构成GJ进而参与胃肠运动的调节。而胆囊的壁层结构与胃肠道的壁层结构相似,胆囊ICC和胃肠ICC的超微结构同样具有相似之处,胆囊中是否也有Cx43、Cx45的表达,是否与胃肠道中Cx43、Cx45和ICC之间的关系相似,参与胆道动力的调节不得而知。我们从这个角度来研究Cx43、Cx45和ICC在胆囊运动中的关系及相关作用。茵陈蒿汤作为在经方中治疗阳黄的经典方,主要用于清热除湿、疏肝利胆和其他病症的治疗[4、5],在治疗慢性结石性胆囊炎有着十分显著的功效。本课题组2研究发现[6],其在治疗慢性结石性胆囊炎中ICC的数量较病变时显著提高,为加深了解该药与慢性结石性胆囊炎之间和胆囊ICC之间的关系,需通过细胞层面近一步的研究。目的:第一部分:通过病例分析,茵陈蒿汤对慢性结石性胆囊炎患者中胆囊收缩功能的影响。第二部分:本次实验通过给予实验动物豚鼠高胆固醇的致石饲料的方法[21],建立慢性结石性胆囊炎的慢性模型,并在8周后给予治疗组中药茵陈蒿汤灌胃。各组分别对胆囊通过HE染色、免疫组化及免疫荧光等实验方法,观察各组胆囊ICC的数量及形态的变化,各组胆囊中Cx43、Cx45蛋白与ICC的表达变化。探讨Cx43、Cx45与ICC之间的相关作用,以及茵陈蒿汤对胆囊中Cx43、Cx45和ICC的影响。方法:第一部分:1.选取大连医科大学附属第一医院和大连医科大学附属第二医院近两年的慢性结石性胆囊炎患者,按照该疾病的诊断标准指标筛选,随机分为茵陈蒿汤治疗组和清热利胆颗粒治疗组,同时选取无相关胆道系统疾病的志愿者作为对照组,一同进行研究。2.通过B超测定各组胆囊收缩率指标,将上述数据录入数据库中,进行统计学分析,观察患者与对照组人员上述指标的差异以及患者治疗前后上述指标的变化。第二部分:1.选取实验用普通级豚鼠,均为雄性,3-4个月龄,体重250-300克,之后随机分组,分为三个组正常组、模型组和治疗组。进行分组喂养,正常组豚鼠喂食正常豚鼠合成饲料,同时模型组和治疗组喂食经过上文的配制方法,配制好的致石饲料,饲养周期为8周。8周后,给治疗组以茵陈蒿汤灌胃。正常组和模型组使用同体积生理盐水替代中药做对照,并继续之前的饲养计划,一共施行4周。2.分别取各组胆囊,行冰冻切片,经过固定、脱水、染色等步骤进行HE染色,并在光镜下观察各组胆囊的病理学变化,之后经过独立双盲原则请病理科老师进行评定,验证模型建立是否成功。3.分别取各组胆囊组织,通过固定、包埋、孵育等免疫组化步骤和免疫荧光双标免疫步骤后,封片保存,观察各组胆囊肌层中Cx43、Cx45的表达数量以及与ICC之间的关系,并采集有用图像,分析平均光密度值。结果:第一部分:1.茵陈蒿汤和清热利胆颗粒两组药物治疗前分别与对照组相比胆囊收缩率显著下降(P<0.05),其胆囊收缩功能表现为不良状态。2.茵陈蒿汤和清热利胆颗粒两组药物治疗后分别与其治疗前相比较胆囊收缩率显著提高(P<0.05),可知两种药物都有显著提高胆囊收缩功能。3.茵陈蒿汤和清热利胆颗粒两组药物治疗后对比两组无明显差别(P>0.05)但茵陈蒿汤相较明显。第二部分:1.HE染色显示,根据细胞形态学和组织结构的变化,模型组中粘膜上皮细胞排列紊乱,有上皮脱落,粘膜下肌层水肿代偿性肥大,可见大量淋巴细胞侵润。2.免疫组化结果显示,在胆囊肌层中有Cx43、Cx45的表达,呈褐黄色。模型组Cx43、Cx45的表达数量及颜色较正常组有显著下降(P<0.05),治疗组Cx43、Cx45的表达数量及颜色较模型组显著提高(P<0.05)。3.免疫荧光结果显示,模型组与正常组相比较,Cx43、Cx45和ICC表达的荧光强度显著降低(P<0.05);治疗组与模型组比较,Cx43、Cx45和ICC表达的荧光强度有明显提高(P<0.05)。结论:1.在胆囊肌层组织中存在Cx43、Cx45蛋白,并且在慢性结石性胆囊炎中Cx43、Cx45的表达有显著下降。茵陈蒿汤治疗后,有明显提高。2.在慢性结石性胆囊炎的形成中,ICC的结构损坏及表达显著下降,Cx43、Cx45的表达也明显下降,Cx43、Cx45和ICC有着相同的表达规律,并与胆道动力之间发生相应的联系。3.经过治疗组可知,茵陈蒿汤对治疗慢性结石性胆囊炎有明显的效果。