在肿瘤细胞中，经典Wnt信号通路的关键因子β-catenin在细胞质中发生蓄积，进而转移入细胞核内与转录因子Lef/TCF(Lef, lymphoid enhancer factor; TCF，T-cell factor protein)结合形成转录复合体，激活包括cyclin D1等一系列Wnt下游靶基因的转录。我们先前已经报道了p120ctn-1亚型能够上调β-catenin的表达，而p120ctn-3却不能。但有趣的是，p120ctn-1和3两种亚型均可以通过调节cycinD1进而影响细胞增殖和细胞周期的进程。有理由推测p120ctn-1是通过调节β-catenin而上调cyclin D1进而影响细胞增殖和细胞周期的。然而到目前为止，p120ctn-3亚型调节细胞增殖和周期的潜在分子机制仍不清楚。　　 我们先前的研究已经证实，在肺癌组织和肺癌细胞系中核BTB/POZ-ZF转录抑制因子Kaiso能够与p120ctn结合。尽管从理论上讲，不同p120ctn亚型均有与Kaiso结合形成复合体的能力，但每一种p120ctn亚型与Kaiso的粘附能力很可能是不同的。有意思的是，cyclin D1的启动子区恰好含有KBS序列(Kaiso-bindingsites)，Kaiso可以识别该序列并与之结合，发挥转录抑制因子的功能。因此，cyclinD1很可能是Kaiso潜在的下游靶基因之一。　　 由于Kaiso与p120ctn的结合部位—锌指结构恰恰也是Kaiso与cyclin D1启动子区KBS序列的结合部位。我们设想:p120ctn-3很可能是通过与Kaiso的结合，占据了Kaiso与KBS结合的位点，解除了Kaiso对cyclinD1的转录抑制作用，进而上调了cyclinE的表达，而影响细胞周期。为此，我们拟通过干扰p120ctn后分别恢复p120ctn-1A和3A，以及过表达和敲除Kaiso和β-catenin，探讨p120ctn-1和3亚型调控肺癌细胞增殖和周期的潜在的不同机制。并构建两种p120ctn-1和3亚型结构差异的氨基端剪切体质粒，以明确p120ctn-1和3亚型功能差异的具体分子机制。　　 材料与方法　　 一、细胞培养　　 人类肺腺癌细胞系SPC和A549购买于美国ATCC(Manassas，VA，USA)。分别在含有10％胎牛血清(GBICO Inc.，NY, USA)的RPMI1640培养基(GBICO Inc.，NY,USA)和含有10％胎牛血清的DMEM培养基(GBICO Inc.，NY, USA)中培养(37℃，5％ CO2)。　　 二、质粒构建及转染　　 p120ctn-siRNA(由上海吉凯基因化学技术有限公司构建，GeneBank＃:001331)，p120ctn-1A和p120ctn-3A(Reynold教授惠赠)，核定位质粒NLS-p120ctn-1和NLS-p120ctn-3（由大连宝生物公司构建），两个p120ctn-1氨基端剪切体质粒M1(氨基端1-55氨基酸残基缺失)和M2(氨基端56-101氨基酸残基缺失)由大连宝生物公司构建，Kaiso(Juliet M.Daniel教授惠赠)、siRNA-Kaiso（干扰序列由美国冷泉港实验室CSHL权威数据库提供，由大连宝生物公司合成）和siRNA-β-catenin、siRNA-cyclin D1和siRNA-cyclin E(Santa Cruz Biotechnology Inc,CA,USA)，以转染空质粒和未转染的细胞为对照。转染用试剂Lipofectamine2000(Invitrogen，CA,USA)或Attractene Transfection Reagent(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)，具体操作步骤按说明书进行。取各转染组细胞及未转染细胞，进行各项检测。　　 三、四甲基偶氮唑盐(tetrazolium，MTT)法检测细胞增殖　　 接种24小时后加入各种处理因素。处理后第24、48、72、96小时分别加入MTT(5mg/ml)20μl，继续孵育4小时后，每孔加入150μlDMSO溶解结晶，选择波长550nm在酶联免疫(ELISA)检测仪上测定各孔吸光度。取3次实验的平均值绘制细胞生长曲线。　　 四、流式细胞仪检测细胞周期　　 收集对数生长期细胞制成1×107个/ml细胞悬液。取1ml细胞悬液于75％冷乙醇中4℃固定过夜、离心后制成500μl的细胞悬液，加碘化丙啶染液(Sigma)于4℃避光孵育45分钟后上机检测(BD Biosciences)，ModFitLT3.0软件分析细胞周期。　　 五、RT-PCR　　 Trizol Reagent(Invitrogen，CA，USA)提取总RNA，具体操作步骤按说明书进行。用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(TaKaRa Biotechnology Co.,Japan)逆转录获得cDNA，以反转录获得的cDNA为模板，PCR所用引物和反应条件如表1。PCR产物电泳后用EB(ethidium bromide)染色，BioImaging Systems(UVP, CA，USA)成像。用NIH image软件分析产物条带灰度，以目的产物条带灰度值与β-actin产物条带灰度值的比值作为mRNA的相对表达量。　　 六、Western blot　　 收集细胞，按体积比1∶5加入蛋白裂解液提取总蛋白，或用皮尔斯公司核浆分离试剂盒，分别提取核/浆蛋白，具体步骤按说明书严格进行。电泳后将蛋白转印到PVDF膜(Sigma-Aldrich，Inc.MO，USA)上，3％小牛血清封闭后，分别用鼠抗人Kaiso单克隆抗体(1∶500，Upstate Biotechnology, USA)，鼠抗人p120ctn单克隆抗体（1∶500，BD Tranduction Laboratories，USA），鼠抗人cyclinD1抗体(1∶200，SantaCruz Biotechnology Inc, CA, USA)，鼠抗人cyclinE(1∶500, BD Biosciences, USA),山羊抗人β-actin多克隆抗体(1∶500，Santa Cruz Biotechnology Inc.，CA，USA)4℃孵育过夜，二抗(anti-goat and anti-mouse secondary antibodies from Santa CruzBiotechnology Inc.，CA，USA)37℃孵育2小时后ECL(Thermo Fisher Scientific Inc，Fremont, CA，USA)发光，曝光胶片(Kodak film KODAK, Japan)后，蛋白条带经BioImaging Systems(UVP, CA，USA)采集后进行灰度值测定，目的蛋白与内对照β-actin灰度值的比值作为其相对蛋白表达量。　　 七、染色质免疫共沉淀(ChIP)　　 在GENEBANK中查找出cyclinD1启动子基因序列(GenBank:AY439218.1)，设计相应含有KBS序列的启动子片段引物（委托TAKARA公司完成），上游5’-CCCTCTCATGTAACCACGAA-3’，下游5’-TGGTTTTGTTGGGGGTGTAG-3’，退火55℃，扩增片段为179bp。用Upstate公司ChIP试剂盒，具体步骤按说明书进行。RT-PCT检测最终目的片段。　　 八、共聚焦免疫荧光染色　　 转染24小时，细胞经4％的多聚甲醛原位固定后，用0.2％的triton-X100于常温打孔，1％的BSA常温封闭30分钟后加入一抗，p120ctn(1∶200)和Kaiso羊多抗(SantaCruze Biotechnology，USA1∶100)，4℃孵育过夜。分别在暗室中加入兔抗羊二抗TRITC1∶100(ZSGB-Bio，China)，羊抗鼠二抗FITC1∶100(ZSGB-Bio，China)，各孵育1个小时，PBS冲洗后，加入Hoechst(1∶200)，室温孵育20分钟后，荧光显微镜观察。　　 九、免疫共沉淀　　 向提取的蛋白中加入4μg的诱饵蛋白抗体，充分混匀后4℃孵育2小时，再加入25μl Protein G Microbeads，混匀后继续4℃孵育1小时，过μ柱。按照操作说明步骤操作进行，Westetn blot进行检测。　　 十、统计分析　　 使用SPSS13.0统计软件进行结果统计。所有以均数±标准差（(X)±SD）表示的数据，其实验至少重复3次，使用Mann-Whitney U test和Kruskal-Wallis test统计Western blot、RT-PCR、MTT assay、细胞周期及ChIP的结果。P值＜0.05具有统计学意义。　　 结果：　　 一、p120ctn-1A和3A都能上调cyclinD1，进而上调cyclinE而影响细胞增殖和周期　　 干扰p120ctn后cyclinD1和cyclinE的蛋白和mRNA表达均下调，细胞增殖下降，G0/G1细胞比例升高，S期比例下降;转染p120ctn-1和3亚型后，cyclinD1和cyclinE的表达恢复，但同时用siRNA干扰cyclinD1的表达或使用cyclinD1的单克隆抗体封闭cyclinD1的功能，则cyclinE的表达不但没有提高反而略有下调。　　 二、p120ctn-1A通过β-catenin途径上调cyclinD1的表达　　 转染p120ctn-1能明显上调β-catenin和cyclinD1的表达，而共转染p120ctn-1A和siRNA-β-catenin则cyclinD1的表达不上调;p120ctn-3不能上调β-catenin的表达，但仍然能够上调cyclinD1的表达。p120ctn-1氨基端的56-101氨基酸残基对上调β-catenin的表达是至关重要的，p120ctn-3很可能正是由于缺少了这个结构才不能上调β-catenin的表达。　　 三、p120 ctn-3A通过调节Kaiso核/浆穿梭上调cyclinD1的表达　　 Kaiso既能与p120ctn-3结合，又能与cyclinD1启动子区的KBS序列结合，转染Kaiso使cyclinD1表达下调，干扰Kaiso使cyclinD1的表达上调;过表达p120ctn-3后Kaiso在核内分布减少，Kaiso与cyclinD1启动子区KBS序列结合减少，cyclinD1表达上调，转染p120ctn-3强制入核质粒，或用来普霉素阻滞p120ctn-3的出核，则Kaiso在核内分布明显增多。p120ctn-1氨基端1-55个氨基端残基内含有螺旋卷曲结构域(coiled coil domain)，可能阻碍了p120ctn-1与Kaiso的结合，而螺旋卷曲结构域缺失的p120ctn-3则能够很好的与Kaiso结合。　　 结论：　　 1、p120ctn-1和3亚型均通过上调cyclinD1，进而上调cyclinE而影响细胞增殖和周期。　　 2、p120ctn-1通过上调β-catenin进而上调cyclinD1，p120ctn-3通过与Kaiso结合并携带其出核，使Kaiso与cyclinD1启动子区域KBS序列的结合减少，进而上调cyclinD1的表达，Kaiso的出核依赖于p120ctn-3的存在和出核。　　 3、p120ctn-1氨基端的56-101氨基酸残基对上调β-catenin的表达至关重要，而氨基端的1-55氨基酸残基中的螺旋卷曲结构域阻碍其与Kaiso的结合;p120ctn-3由于不具有这两部分结构导致其不能上调β-catenin的表达，但却可以结合并转移Kaiso出核，氨基端的结构差异导致p120ctn-1和3亚型通过两种截然不同的机制发挥上述生物学功能。