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叶是高等植物重要的侧生器官。研究表明,叶发育的调控机理十分复杂。环境因素和植物自身发育过程的基因共同作用调节叶的发育。单子叶禾本科植物的叶与双子叶植物的叶在形态和结构上具有明显的差异,两者的发育调节机制也可能存在差异。近年来,人们借助于拟南芥、金鱼草等一些模式材料进行植物叶发育的研究,对双子叶叶发育的调控机理有了较深入的了解。但是对于单子叶植物叶发育过程的分子机制了解甚少。水稻(Oryza sativa L.)属于单子叶禾本科植物,也是一种重要的粮食作物,研究其叶的发育具有重要的理论及生产实际意义。编码LATERAL ORGAN BOUNDARIES(LOB)-Domain的基因为植物所特有,他们构成了一个基因家族,对植物的生长发育起重要调节作用。在双子叶植物中,已有的研究结果表明,许多具有LOB-Domain的基因决定叶等侧生器官的极性建立,并对侧生器官的发育起重要的调控作用。本研究从水稻中分离出两个具有LOB-Domain基因保守区域特征的基因,并对其表达模式及功能进行了分析,研究工作为揭示水稻侧生器官发育的分子机理提供了重要资料。主要结果和结论如下:1.OsAS2的分离及其序列特征从水稻的幼叶中分离出OsAS2(Oryza sativa ASYMMETRIC LEAVES2)(EF540766)。OsAS2基因的cDNA全长为824 bp,编码270个氨基酸残基。对其编码的氨基酸序列分析表明,该基因编码的氨基酸序列具有LOB-domain,在LOB-domain中具C结构域和GAS结构域,是LOB-Domain基因家族第一类基因成员。氨基酸序列比较分析与分子进化树分析表明,OsAS2蛋白与拟南芥的AS2聚合在一起,是拟南芥AS2的同源基因。2.OsAS2的表达模式分析应用RT-PCR方法及原位杂交的方法对OsAS2表达模式进行了分析。OsAS2在水稻的营养器官(根、茎、叶)和生殖器官(花及授粉后的种子)中广泛表达,在幼嫩的器官中表达水平相对较高。原位杂交结果显示,与拟南芥AS2不同,该基因在水稻苗端分生组织中表达,但相对较弱,在叶原基、幼叶及生殖器官中表达较强。OsAS2的mRNA主要在幼叶的远轴面积累。以上结果表明,OsAS2基因可能参与苗端分生组织的特征决定及侧生器官的发育调控。3.OsAS2在拟南芥和水稻中的功能分析过量表达拟南芥的AS2影响其侧生器官的发育及叶的近远轴极性建立。转35S::AS2植株的子叶及叶均向近轴面卷曲,叶狭长,在叶背面有的形成指状突起;在开花期,部分转基因植株的花序不伸长,花梗短,花萼背面有凸起,花瓣向内卷曲,花不育。组织学分析表明其叶肉组织近-远轴极性分化异常。为了比较OsAS2基因与拟南芥AS2基因的功能,我们构建了35S::OsAS2正义表达载体,转化野生型拟南芥。所有转35S::OsAS2的拟南芥植株均比野生型植株明显矮小,叶狭窄,叶柄短而且较宽,叶片的延展受到严重限制;子叶及叶向近轴面弯曲,并常扭曲,在叶的远轴面形成突起;在开花期,转35S::OsAS2的植株花序几乎不伸长,花器官发育异常,雄蕊花丝伸长受到抑制,子房比野生型短,花常不育。对35S::OsAS2转基因拟南芥植株莲座叶的组织学分析表明,转基因植株叶片的叶肉组织极性分化异常,远轴面细胞被具有近轴面特征的细胞取代。以上研究结果表明,OsAS2与拟南芥AS2基因在决定叶近远轴极性建立的功能上具有一定的保守性,但它们的功能也存在一定的差异。OsAS2影响拟南芥苗端分生组织及侧生器官的正常发育。为进一步研究OsAS2的功能,分别构建ubi::OsAS2正义表达载体及ubi::anti-OsAS2反义表达载体,转化水稻。与对照相比,转ubi::OsAS2的愈伤组织可产生绿色芽点,但分化延迟。其中只有极少数绿色芽点能进一步分化产生异常的具有叶状结构的苗,随后停止发育。组织学分析结果显示,转ubi::OsAS2愈伤组织的细胞能保持较长时间的分裂能力,但是细胞分化受到抑制。转基因愈伤组织中促进细胞分裂的基因Orysa;CYCD3;1表达量提高。在分化绿色芽点的组织中,检测到水稻分生组织特征基因OSH1(Oryza sativa homeobox1)及影响侧生器官分化的OsWOX3(Oryza sativa WUS-like homeobox3)基因有较高水平的表达。而转反义基因的愈伤组织与对照的愈伤组织相似,可分化成苗,其表型正在进一步分析中。上述研究结果表明,不同于双子叶植物拟南芥的AS2基因,水稻OsAS2基因不仅调节侧生器官的发育,而且在维持苗的正常分化方面亦起重要作用。在水稻中,OsAS2可能通过调节细胞分裂相关基因及分生组织特征基因的表达水平,维持苗的正常分化及侧生器官的正常发育。4. OsLOB1的分离及其表达模式我们从水稻的根尖分离了OsLOB1(Oryza sativa LOB1)(EF540767)。OsLOB1基因的cDNA全长为774 bp,编码253个氨基酸残基。氨基酸序列分析表明,该基因编码的氨基酸序列也具有LOB-domain,在LOB-domain中具C结构域和GAS结构域,也是LOB-Domain基因家族第一类基因成员。氨基酸序列比较分析与分子进化树分析表明,OsLOB1与拟南芥的LOB聚合在一起,为水稻的LOB同源基因;OsAS2与OsLOB1之间也具有较高的同源性。原位杂交结果显示,OsLOB1的表达模式与OsAS2相似,在苗端分生组织、叶原基、幼叶及花器官中均有表达,但OsLOB1的mRNA在幼叶中积累无极性。以上结果表明, OsLOB1基因可能参与苗端分生组织的特征决定及侧生器官的发育调控。