研究背景：随着社会的发展,恶性肿瘤的发病率越来越高,已经成为威胁全世界人类健康和生命的最重要的原因之一。据统计在15～35岁青年男性中,睾丸癌是最常见的恶性肿瘤之一。近些年来,睾丸癌在全球发病率明显有逐渐增加的趋势,据统计睾丸癌的发病率以每年1%-2%的速度增长。在我国,睾丸癌的发病率及死亡率平均在1/10万左右。与其他肿瘤相比,虽然睾丸癌的发病率低,但恶性率较高。在睾丸肿瘤中,95%肿瘤为睾丸生殖细胞肿瘤(Testicular germ cell tumors, TGCTs)。据报道,男性不育是TGCTs的一种临床危险因素。据美国的研究调查显示,最近25年来睾丸癌的罹率显著增加,增加的比例与同期男性不育症增加的比例十分相似。通过大样本案例的追踪发现,特发性少弱畸精子症的男性,罹患生殖细胞肿瘤的几率比一般人高出20倍。经过多年以来的研究分析,虽然我们对肿瘤发病机制的研究越来越细致,累计了大量的临床资料和实验资料,但是我们至今没有解决肿瘤起源的问题。而通过肿瘤细胞胚胎性起源假说可以解决这个问题,其表示肿瘤细胞来源于胚胎,因此,从肿瘤的来源方面为我们在抗肿瘤研究中提供了新方向和新思路。随着分子肿瘤学、细胞生物学、实验胚胎学、免疫胚胎学、实验肿瘤学等学科的飞速发展,有利于研究者们更深入的分析胚胎发育与肿瘤生成之间的联系,并且当前大量的研究均表明这两者间联系十分密切。“肿瘤的胚胎源性”理论指出肿瘤细胞发源自肿瘤干细胞,而原始生殖细胞来源于胚胎生殖干细胞,同样具有迁移、增殖性和分化性。实验结果显示：在一定的环境中,肿瘤细胞与受精卵能够互变互通,肿瘤细胞能够类似于受精卵发育产生胚胎,而把动物的受精卵移植到睾丸内则可形成畸胎瘤。它们在基因水平上、蛋白水平上、生物学行为上有着很多的相似性。Spata6 (spermatogenesis associated protein 6)基因是一个进化保守的睾丸特异性基因,如同Spatal、Spata3等,也是一个精子发生相关的基因,Spata6基因由15个外显子组成,编码488个氨基酸的蛋白。Spata6失活可能导致男性不育和无头精子症。它特异性表达在单倍体的生殖细胞中。基于以上背景,考虑到睾丸生殖细胞肿瘤与精子均可认为是胚胎干细胞源性的产物,我们推测Spata 6很可能通过参与TGCTs。为了证明这个假设,本实验通过上调和下调Spata6,研究和了解其对人类胚胎癌细胞衍生细胞系NTERA-2细胞增殖和凋亡的影响以及下游蛋白变化,旨在探讨Spata6是否参与睾丸肿瘤细胞凋亡过程。细胞凋亡指的是为了使内环境处于稳态,在相关基因的调控下细胞发生有序的、自主的死亡。其不同于细胞坏死,细胞凋亡为主动过程,该过程中能够活化、调控及表达相应的基因；并且该现象不是表示细胞自体受损,而是属于细胞为了更好的与生存环境相适应,进而表现出的一种主动的死亡现象。细胞凋亡参与了癌症的起始过程,并对癌症的发生起负调控作用,与其有着密切关系。另一方面凋亡与男性不育症也有着密切的关系。精子凋亡与男性不育症之间也存在着非常明确的关系,可以影响到男性的精液量、精子密度,精子活率、畸形率等。研究发现P53、Bcl-2家族等调节因子在细胞凋亡、精子发生等过程中具有重要的作用,尤其是Bcl-2家族将会发挥关键的功能,也是当前相关领域研究者重点关注的研究内容。在Bcl-2家族内bax是代表性最强的促凋亡基因,Bcl-2是代表性最强的抑制凋亡基因。在肿瘤细胞中,表达的Bax水平降低,但Bcl-2水平上升。因此,对Bax进行下调或对Bcl-2水平进行上调可对很多肿瘤细胞凋亡过程发挥抑制效应。反之,对Bax水平进行上调、Bcl-2水平下调对肿瘤细胞凋亡过程能够发挥促进效应。因此,我们推测转染pcDNA3.1 (+)-Spata6和Spata6沉默序列siRNA后影响了相关凋亡基因Bax或Bcl-2的表达,从而导致了睾丸肿瘤细胞的凋亡和增殖活性发生了变化。研究目的：本实验是为了解Spata6对人类胚胎癌细胞衍生细胞系人睾丸畸胎瘤细胞NTERA-2(Testicular embryonal carcinoma cells)细胞增殖和凋亡的影响以及Spata6蛋白表达变化对其下游蛋白变化的影响,探讨Spata6是否参与睾丸肿瘤细胞的凋亡,探究其发生的作用机制和途径,进一步揭示男性不育症与睾丸恶性肿瘤的关系。从精子发育生物学的角度认识睾丸肿瘤,并对精子发育和睾丸肿瘤发生之间联系的进一步研究,有利于我们深入地理解两种生命现象的内涵,并补充“肿瘤的胚胎源性”这一含义。帮助相关领域的研究者回归到生命现象中去探讨睾丸肿瘤的相关问题,找出睾丸肿瘤发生过程的薄弱环节和靶基因进行干预,为寻找新的靶基因提供基础研究,进一步发现TGCTs潜在的药物治疗方法。1.通过分别将Spata6基因序列的真核表达载体PcDNA3.1重组入NTERA-2细胞以及利用siRNA技术将Spata6沉默序列siRNA转染NTERA2细胞后,使用蛋白质免疫印迹方法检测Spata6蛋白的表达量,研究上调和下调Spata6基因对Spata6蛋白表达变化的影响。2.通过分别将Spata6基因序列的真核表达载体PcDNA3.1重组入NTERA-2细胞以及利用siRNA技术将Spata6沉默序列siRNA转染NTERA-2细胞后,运用MTT法细胞增殖实验研究分析Spata6基因表达上调或者下调后对NTERA-2细胞生长活力的影响。3.通过分别将Spata6基因序列的真核表达载体PcDNA3.1重组入NTERA-2细胞以及利用siRNA技术将Spata6沉默序列siRNA转染NTERA-2细胞后,应用流式细胞术研究分析Spata6基因表达上调或者下调后对NTERA-2细胞凋亡的影响。4.通过分别将Spata6基因序列的真核表达载体PcDNA3.1重组入NTERA-2细胞以及利用siRNA技术将Spata6沉默序列siRNA转染NTERA-2细胞后,使用蛋白质免疫印迹的方法分析细胞凋亡调节蛋白Bax和Bcl-2的表达量,分析研究Spata6对NTERA-2细胞Bax和Bcl-2表达的影响,探讨上调和下调Spata6基因对NTERA-2细胞凋亡影响的机制。5.NTERA-2细胞移植到裸鼠皮下成瘤,使用EntransterTM-in vivo动物体内转染方法干扰Spata6在小鼠肿瘤内表达,观察小鼠体内肿瘤体积和重量的变化,了解下调Spata6对睾丸生殖细胞肿瘤的影响。研究方法：1.细胞培养和实验方案本研究选择全球一致认可的-NTERA2细胞系(Testicular embryonal carcinoma cells)。培养后随机的分为四组：(1)正常对照组；NTERA-2细胞正常培养组。(2)Spata6c组,转染Spata6基因真核表达载体PcDNA3.1的NTERA-2细胞组：(3)siSpata6c组；Spata6沉默序列siRNA转染后的NTERA-2细胞组；(4)Spata6c+siSpata6c组,1：1比例组合(2)和(3)。2.质粒和siRNA的设计构建和转染①通过聚合酶链反应(PCR)扩增NTERA-2 cDNA的Spata6基因,将模板和片段构建到pcDNA3.1 (+).然后将重组表达载体pcDNA3.1 (+)-Spata6转染NTERA-2细胞。②设计和合成Spata6沉默序列siRNA并将其转染NTERA-2细胞。3.细胞增殖实验检测细胞增殖活力分别在转染后24小时,48小时,72小时,和96小时收获细胞,通过MTT比色法测定各时间段各组细胞的增殖活力。4.流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡情况流式细胞术(FCM)分析各组细胞的凋亡情况。并使用CellQuest 3软件分析测定结果。5.蛋白质免疫印迹分析通过蛋白质免疫印迹实验分析各组Spata6、Bax和Bac-L的蛋白的表达情况。6.荷瘤鼠实验建立小鼠NTERA-2肿瘤模型,使用ntransterTM-in vivo动物体内转染试剂将Spata6 siRNA注射到小鼠肿瘤内,观察肿瘤生长情况,每间隔7天测量小鼠肿瘤体积,21天后取出肿瘤测量体积并称重。结果：1.在NTERA-2中,转染重组表达载体和siRNA对Spata6蛋白表达的影响。在NTERA-2细胞中,转染24小时后,Spata6c组Spata6蛋白的表达相比对照组和Spata6c+sipata6c组显著增加(P<0.05)。另外,siSpata6c组的NTERA-2细胞中Spata6蛋白质的表达与对照组相比则显著减少(P<0.05)。2.在NTERA-2细胞中,转染重组表达载体和siRNA对细胞增值活力的影响。经MTT测定,在转染后第24小时,三个组的细胞活力无明显差异。转染24小时后,与对照组相比,siSpata6c组的细胞增殖活性明显下降,而Spata6c组细胞增殖活性则明显升高(P<0.05)。3.在NTERA-2细胞中,转染重组表达载体和siRNA对细胞凋亡的影响。转染后48小时,对照组、Spata6c组、Spata6c+siSpata6c组之间细胞凋亡率无明显差异(P>0.5)。而相对于以上三组,siSpata6c组细胞的调亡率显著升高(P<0.05)。4.在NTERA-2细胞中,转染重组表达载体和siRNA对细胞凋亡调节蛋白Bax和Bcl-2表达的影响。相对于对照组和siSpata6c组,Spata6c组的Bax的表达显著升高,而Bcl-2的表达则明显降低。但是对照组与siSpata6c组相比,Bax和Bcl-2的表达无明显差异。5.Spata6siRNA组肿瘤瘤重显著轻于Control siRNA组对照组和生理缓冲液组(P<0.05),体积的差异趋势与瘤重一致。21天后处死裸鼠后,Spata6siRNA组小鼠的肿瘤体积显著小于control siRNA组对照组和生理缓冲液组。结论：在TGCTs细胞中,经蛋白质免疫印迹分析,通过转染重组质粒载体pcDNA3.1 (+)-Spata6和Spata6沉默序列siRNA可以相应的上调和下调Spata6蛋白的表达。结果显示相比于对照组,转染重组质粒载体pcDNA3.1 (+)-Spata6组的TGCTs细胞Spata6的蛋白水平显著升高了,而Spata6沉默序列siRNA转染组的TGCTs细胞的Spata6的蛋白水平则明显降低,并具有统计学意义。这表明重组质粒被成功表达。为了探讨转染后对细胞增殖和凋亡的影响,我们分别使用了MTT法和流式细胞仪测定细胞的增殖活性和凋亡。在细胞增殖活性方面,相比对照组,我们发现经转染Spata6沉默序列siRNA后的细胞存活率显著下降,而转染pcDNA3.1 (+)-Spata6的细胞的存活率则明显上升。另外相对于其他组,转染siRNA抑制Spata6基因的表达后细胞的凋亡率明显提高,这显示下调Spata6基因的表达能够抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。另外为了证实细胞凋亡是由Spata6表达下降引起的,我们探讨了转染pcDNA3.1 (+)-Spata6和Spata6沉默序列siRNA后细胞凋亡相关基因的表达。在许多肿瘤细胞中,细胞凋亡是由Bcl-2家族蛋白调节的。Bcl-2家族是由许多抗凋亡和促凋亡的成员蛋白组成的。其中Bcl-2是一种抗凋亡蛋白,Bax则是一种促凋亡蛋白。我们的结果表明,转染Spata6沉默序列siRNA后,Bax的表达显著升高,而Bcl-2蛋白的表达出现了显著下降。在小鼠体内的实验结果和细胞学的实验结果一致,Spata6基因沉默NTERA-2细胞的成瘤能力相比对照组细胞显著降低。这表明对下调Spata6能通过Bax和Bcl-2促进TGCTs细胞的凋亡。综上所述,下调Spata6可以通过增加凋亡相关基因蛋白的表达来降低细胞活力和细胞生存,致TGCTs细胞株体外凋亡,本研究初步揭示Spata6有作为治疗TGCTs肿瘤的靶标的潜力,并且它也有可能在男性不育症的发生中起到重要的作用,这为以后进一步进行动物体内研究以及更深层次的临床研究提供了重要的依据。