【摘 要】
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目的:构建免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合噬菌体展示文库,为应用各种类型免疫球蛋白对该文库进行体外分子进化筛选及研究免疫球蛋白结合分子结构和功能打下基础。方法:
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目的:构建免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合噬菌体展示文库,为应用各种类型免疫球蛋白对该文库进行体外分子进化筛选及研究免疫球蛋白结合分子结构和功能打下基础。方法:应用overlapping PCR制备Protein A的Z结构域。再用含随机核苷酸序列的引物,制备对Z结构域的第10、13、27、28、31和32位氨基酸进行随机突变的定点随机突变体,并在突变体片段两端引入KpnⅠ位点,3′端引入3个氨基酸大小随机连接肽的序列进行随机连接。突变体片段经KpnⅠ酶切后,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S。克隆产物转化大肠杆菌TG1,辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体展示定点随机突变组合文库。结果:该定点随机突变组合文库的库容为2.7×107个,滴度为1.4×1012 TU·mL-1 ;文库中含0.72以上的阳性克隆,其中有2个单结构域的阳性克隆占0.15;15个样品的序列分析显示各突变位点和随机连接肽的氨基酸序列呈随机性分布。结论:构建了噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库,该库库容量在一级结构上具有良好的随机性和多样性,基本可满足体外分子进化研究的要求。
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