论文部分内容阅读
目的:分别构建含肌酐水解酶及肌酸水解酶的重组质粒转化至大肠杆菌中,研究其蛋白的表达及活性。方法:根据Gen Bank数据库已知的肌酐水解酶(恶臭假单胞菌1978)及肌酸水解酶(黄杆菌U-188)的基因序列,由上海吉凯生物有限公司进行生物合成,得到肌酐水解酶基因片段a及肌酸水解酶基因片段b。根据肌酐酶及肌酸酶的基因序列设计引物,PCR扩增,进行双酶切,回收和纯化,与质粒GV296酶切后进行连接,构建成重组质粒GV296-a及GV296-b,分别转化至大肠杆菌DH5a,筛选测序鉴定。提取重组质粒GV296-a及GV296-b,转入至大肠杆菌BL21(DE3),进行菌液PCR鉴定,得到表达工程菌GV296-a/BL21(DE3)和GV296-b/BL21(DE3),向菌液中加入IPTG诱导其蛋白的表达,并制备粗酶液进行SDS-PAGE分析。将工程菌GV296-a/BL21(DE3)于含特定浓度肌酐的培养基中培养24小时,取培养液测定肌酐浓度;将工程菌GV296-b/BL21(DE3)于含特定浓度肌酸的培养基中培养24小时,取培养液测定肌酸浓度。结果:1.成功构建重组质粒GV296-a及GV296-b,将上述重组质粒进行双酶切,电泳显示目的片段大小分别约为0.783Kb和1.212Kb,与理论值符合。2.重组质粒GV296-a及GV296-b,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后实现高效表达。工程菌GV296-a/BL21(DE3)表达肌酐酶,具有肌酐酶活性,按基因序列图分析肌酐水解酶261个氨基酸,经SDS-PAGE分析酶蛋白的分子量约为29KD,而工程菌GV296-b/BL21(DE3)表达肌酸酶,具有肌酸酶活性,按基因序列图分析肌酸水解酶403个氨基酸,经SDS-PAGE分析酶蛋白的分子量约为43KD。结论:1.成功构建肌酐酶及肌酸酶的重组质粒,经双酶切及测序分析符合理论值。2.成功构建工程菌GV296-a/BL21(DE3)和GV296-b/BL21(DE3),并高效诱导肌酐酶及肌酸酶的表达,具有肌酐酶及肌酸酶活性。