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角质酶(3．1．1．74)是指能催化降解植物表皮不溶性角质的酶。角质酶同时具有酯酶和脂肪酶的某些性质，但又不同于传统的脂肪酶，它不需要油—水界面来完成其催化反应。由于角质酶的这一特性，它能催化合成酯和油脂的水解、酯化及转酯反应。而且角质酶在水相和非水相中都是非常有效的催化剂，因此在纺织、精细化工产品合成等领域有着广泛的应用前景。
本论文以实验室构建的一株能异源表达角质酶的重组E．coli为生产菌株，以胞外角质酶的高产量、高得率和高生产强度为目标，在摇瓶和发酵罐培养中采用基于发酵动力学模型分析的优化与控制等一系列可行的研究方案对重组E．coli的整个发酵过程进行优化，研究的主要结果如下：
通过单因素实验确定葡萄糖为E．coli合成角质酶的最佳碳源，酵母膏为最佳氮源以及IPTG、CaCl2、吐温60、KH2PO4、K2HPO4和氨苄青霉素为E．coli异源表达角质酶的基本发酵培养基成分。采用析因实验、最陡爬坡实验和中心组合设计实验设计方法得到优化的发酵培养基组成为(g．L—1)：葡萄糖33．92，酵母膏30．92，IPTG0．76，CaCl20．1，吐温600．14，KH2PO42．3，K2HPO412．54，氨苄青霉素0．1。发酵条件优化后，重组E．coli异源表达角质酶的胞外产量比未优化条件下的胞外产量提高了2．6倍。
摇瓶与3 L发酵罐的分批发酵结果表明溶氧不仅影响角质酶的产量，而且影响其分泌效率，高溶氧有利于角质酶的分泌。3L罐分批发酵的最佳通气搅拌条件为通气量1．0vvm、搅拌转速450 r·min—1。，在此条件下，胞外角质酶的产量和生产强度均最高。通过分批发酵过程中比生长速率和产物的比生成速率的变化规律，提出了通气搅拌的分阶段控制策略，与单一的通气搅拌控制方式相比，其胞外角质酶的产量提高了21．4％，相应的胞外酶生产强度提高了34．7％，胞外酶的平均比生成速率提高了35．1％。
在不控制pH的条件下，发酵液pH迅速下降，到发酵中后期逐渐回升，整个发酵过程pH的变化幅度达到2左右。在pH5．8—7．8范围内，pH7．3时最有利于角质酶的合成。从角质酶分批发酵动力学角度，分析并解释了pH对重组E．coli细胞生长和角质酶合成的影响这一生理学现象。pH7．3时角质酶的胞外产量及总产量均达到最大，是因为在pH7．3时重组E．coli具备了α值高和β值高、KI值高的特点。
在21℃—37℃范围内，高温有利于重组E．coli细胞的生长和胞内角质酶的合成，而较低温度则有利于角质酶的分泌。分析不同温度下分批发酵动力学参数，发现在25℃以上产角质酶的分批发酵的过程属于生长耦联型，提示提高菌体浓度有可能进一步提高角质酶的产量。而适合菌体生长温度与有利于角质酶分泌的温度不一致，据此，提出发酵温度的分阶段控制策略。与单一发酵温度控制模式的结果相比较，其胞外角质酶的产量分别提高了12％。
在角质酶的分批发酵过程中发现，随着葡萄糖浓度的增加，细胞对葡萄糖的利用速度加快，葡萄糖的平均消耗速率和比消耗速率相应提高，但细胞平均比生长速率和角质酶的平均比生成速率却呈下降趋势，最终细胞和角质酶对葡萄糖的得率均明显降低。因此，仅通过分批发酵难以实现细胞和角质酶高产量、高得率和高生产强度的有机统一。间歇补料、恒速补料和DO—stat补料等分批补料发酵模式都可以实现细胞的高产，但间歇补料和高速率的恒速补料不利于角质酶的合成。综合比较，DO—stat补料对于重组E．coli发酵产角质酶来说，虽然细胞和角质酶对葡萄糖的得率以及比速率等参数稍低于分批发酵，但其胞内、胞外和总角质酶产量与分批发酵相比分别提高了18．9％、27．4％和27．5％，胞外角质酶的生产强度也提高了27．5％，是一种比较可行的选择。
研究了重组E．coli产角质酶DO—stat补料分批发酵过程动力学，用MATLAB拟合出了菌体生长、产物合成与基质消耗的动力学模型。将模型预测值与实测值进行比较，平均拟合误差分别为3．7％、3．5％和3．4％，表明所建立模型能较好地反映E．coli补料分批发酵产角质酶的过程。以体积氧传递系数kLa值相等的原则将重组E．coli DO—stat补料分批发酵产角质酶的过程在30L，发酵罐中进行了初步放大，胞外角质酶的产量达到261．7 U·mL—1，是优化前的6．5倍。
摇瓶和3L罐的发酵实验结果都表明，乳糖诱导有利于细胞的生长，但诱导效果低于IPTG。采用乳糖诱导时，最佳诱导起始时间为对数生长中前期，最佳的诱导温度为31℃，乳糖采用低浓度分批添加方式其效果比一次性添加更明显。在3L罐中，采用分批发酵或分批补料发酵工艺，乳糖诱导表达的胞外角质酶产量均能达到IPTG诱导的90％左右，从成本的角度考虑，乳糖诱导更具优势。
摇瓶和3L发酵罐的实验结果表明，低浓度的吐温60对重组E．coli细胞生长有轻微的促进作用，但效果不明显。吐温60在抑制角质酶合成同时能提高胞外角质酶的产量，这说明吐温60的存在可能改善了细胞膜的透性，提高了角质酶的分泌效率。吐温60能改变细胞膜脂质中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸之间的比例。0．15 g·L—1的吐温60处理后，细胞膜脂质中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸之比从对照的0．57提高到0．94，提高了细胞膜的流动性，从而增大了细胞膜的透性。在发酵过程推迟吐温60的添加时间能有效的降低吐温60对角质酶合成的抑制，提高角质酶的总产量，进而提高其胞外酶产量。电子显微镜可以观察到，经吐温60处理后，重组E．coli细胞形态发生明显变化，表面变得粗糙，甚至细胞不完整，表明处理后的细胞膜结构发生变化，通透性增强。