目的:明确人工模拟外湿环境对正常及脾阳虚大鼠一般情况、脾组织形态学改变、脾组织蛋白质差异表达的影响,探讨湿邪对不同体质(正常与脾阳虚)机体的致病机理。方法:1.选取40只SD大鼠随机分为对照组、脾阳虚组、外湿组、脾阳虚加外湿组,每组10只。脾阳虚组模型制作采用番泻叶灌胃与皮下注射利血平交替进行并强迫大鼠游泳的复合方法。脾阳虚造模后,给予外湿组与脾阳虚加外湿组人工模拟外湿环境一周,于造模前后观察并记录各组大鼠的一般情况包括体质量、进食量、饮水量、精神活动、皮毛光泽度及大便性状并进行宏观症候评分。2.模拟外湿环境造模完成后,无菌摘除脾脏,采用Con A诱导脾淋巴细胞增殖,以此表示淋巴细胞的功能水平。记录并计算脾淋巴细胞增殖能力。3.模拟外湿环境造模完成后,取脾组织进行常规脱水、浸蜡、包埋。每个组织块切取5张切片,60℃恒温箱内过夜干燥切片,5张切片均做常规的HE染色,光镜下观察形态学变化。4.模拟外湿环境造模完成后,取出脾组织10mg/只,进行双向电泳实验以及图象分析,采用肽质量指纹图谱和电喷雾串联质谱的方法鉴定蛋白质。结果:1.外湿对正常及脾阳虚大鼠一般情况的比较。外湿环境下脾阳虚大鼠较正常大鼠体质量明显减轻,脾阳虚加外湿组大鼠体质量(239.30±37.60)较外湿组(321.70±18.74)显著降低,P<0.01。脾阳虚加外湿组大鼠在进食、饮水、精神状态、毛色、大便性状等方面较外湿组发生了一定的变化。脾阳虚加外湿组大鼠进食量(19.33±2.88)较外湿组(23.83±2.93)降低,P<0.05。外湿组(37.50±1.87)、脾阳虚加外湿组大鼠饮水量(36.67±4.18)较对照组(42.67±2.34)显著降低,P<0.01。脾阳虚加外湿组大鼠造模初期出现情绪逐渐改变,呈现易激怒、好争斗状态,放在泳池中游泳时,纷纷跃起。造模后逐渐出现精神萎靡不振,扎堆,嗜睡,反应迟钝,行动迟缓,毛色枯槁,消瘦,粪便软、不成形,甚至稀溏。外湿组大鼠脱毛现象较轻,精神状态较好,偶可见嗜睡,抓取时叫声比较温柔。2.外湿对正常及脾阳虚大鼠脾淋巴细胞增殖力的比较。外湿环境下,脾阳虚大鼠与正常大鼠脾淋巴细胞增殖力较对照组均显著降低。与对照组脾淋巴细胞增殖力(47.94±1.13)相比,外湿组脾淋巴细胞增殖力(15.15±2.18)、脾阳虚加外湿组脾淋巴细胞增殖力(14.42±2.24)均显著降低P<0.01。脾阳虚加外湿组脾淋巴细胞增殖力(14.42±2.24)较外湿组脾淋巴细胞增殖力(15.15±2.18)无差别P=0.476,P>0.05。与脾阳虚加外湿组脾淋巴细胞增殖力(14.42±2.24)相比,脾阳虚组脾淋巴细胞增殖力(36.07±3.05)显著增强P<0.01。3.外湿对正常及脾阳虚大鼠脾组织形态学的改变。外湿组大鼠脾组织白髓边缘带增宽,白髓发生中心增大,脾索内见吞噬浅黄色色素细胞。脾阳虚加外湿组大鼠脾组织白髓边缘带增宽较明显,脾窦内见吞噬浅黄色色素细胞,脾窦扩张、充血,脾索内见吞噬浅黄色色素细胞。4.外湿对正常及脾阳虚大鼠脾组织差异蛋白斑点表达情况的比较。各实验组选三个样本进行差异蛋白组学比较,两两比较差异蛋白图谱,进行蛋白质组学分析,鉴定出40个蛋白斑点,脾阳虚加外湿组与对照组比较表达上调的有13个,表达下调的有20个;外湿组与对照组比较表达上调的有14个,表达下调的有19个;外湿组与脾阳虚加外湿组比较表达上调的有15个,表达下调的有10个。5.外湿对正常及脾阳虚大鼠脾组织差异蛋白质的比较。在实验组2-DE凝胶上从表达差异蛋白质斑点中选取点影像清晰且表达水平改变明显的22个蛋白质斑点作为最终质谱鉴定的对象,利用PMF的方法成功鉴定了20个蛋白质。外湿环境下正常大鼠表达上调的有11个,它们是载脂蛋白A-I、苹果酸脱氢酶、特定短链酰基辅酶A脱氢酶、半乳糖凝集素5、低分子量的磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶LMW-PTP、阴离子型胰蛋白酶原-2、胞内氯离子通道蛋白1、f肌动蛋白β亚基、磷酸甘油酸变位酶1、膜突蛋白、肌动蛋白相关蛋白2/3复合物亚基5,表达下调的有4个,它们是3-磷酸甘油醛脱氢酶、哺乳动物过氧化物酶2、Igκ链C区,B等位基、结合珠蛋白。外湿环境下脾阳虚大鼠表达上调的有9个,它们是载脂蛋白A-I、苹果酸脱氢酶、特定短链酰基辅酶A脱氢酶、半乳糖凝集素5、低分子量的磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶LMW-PTP、阴离子型胰蛋白酶原-2、胞内氯离子通道蛋白1、磷酸甘油酸变位酶1、膜突蛋白,表达下调的有5个,它们是3-磷酸甘油醛脱氢酶、哺乳动物过氧化物酶2、结蛋白、Igκ链C区,B等位基、肌球蛋白调节轻链9。结论:1.模拟外湿环境因素对正常及脾阳虚组大鼠的一般情况都有影响,包括体质量、进食量、饮水量、精神状态、活动度、皮毛光泽、皮肤黏膜、排泄物等方面,并且对脾阳虚组影响更为明显。2.模拟外湿环境因素显著降低了正常及脾阳虚组大鼠细胞免疫功能。模拟外湿环境因素(外因)相对于脾阳虚因素(内因)对机体免疫抑制作用更强。模拟外湿环境因素(外因)与脾阳虚因素(内因)具有协同致机体免疫机能下降的作用。3.模拟外湿环境因素对正常及脾阳虚大鼠脾组织形态学都有影响,但脾阳虚大鼠脾组织形态改变明显,表现在组织细胞病变加重。4.模拟外湿环境因素对正常及脾阳虚大鼠脾组织蛋白质存在差异表达。模拟外湿环境因素与脾阳虚因素作用于机体差异蛋白质有其特异性,但也存在交集,且交集很大。这些差异蛋白质功能与细胞结构、能量代谢、细胞凋亡、细胞增殖与分化、信号转导、钙稳态调节、免疫应答、免疫保护、肿瘤发生相关。不同因素作用下的特异性差异蛋白质可能是与脾阳虚证及湿邪侵袭相关的疾病特异性蛋白,并有可能成为诊断脾阳虚证的分子标志物及湿邪致病的分子标志物。