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研究背景及目的镉作为环境毒物和生产毒物,于上世纪90年代被国际癌症研究机构(IARC)确定为致癌物。人体主要通过吸入镉烟尘或镉化合物粉尘而引起机体急性或慢性的损害,并引起全身性疾病。镉进入机体后通过多种复杂的途径对器官和组织产生损害,但其详细毒作用机制尚不清楚。目前认为,进入体内的Cd首先蓄积在肝脏,诱导肝细胞合成金属硫蛋白(MT),并与之结合生成Cd-MT复合物随血液循环至肾脏,经肾小球滤过和肾小管吸收进入近端肾小管S1段并沉着,经溶酶体降解成Cd2+通过氧化损伤引起的转运蛋白功能改变和线粒体呼吸衰竭,诱导肾小管细胞凋亡。慢性镉暴露时体内的Cd主要蓄积于肾脏,并通过氧化损伤、钙通道失调等导致肾功能损伤和肾衰竭等。因此治疗慢性镉中毒时,主要是考虑肾脏镉的清除及肾脏修复。大量研究表明,目前临床常用的重金属(铅、汞等)中毒的络合剂对慢性镉中毒无疗效。新型驱镉络合剂N-(2,3,4,5,6-五羟基己基)N-(二硫代甲酸钠基)-蛋氨酸钠,简称GMDTC,是在二硫代氨基甲酸酯类(DTC)的基础上,采用葡萄糖胺基—甲硫氨基取代DTC,蛋氨酸取代R1,用D-葡萄糖胺基取代R2而合成的新型化合物。本课题前期研究表明,GMDTC具有良好的驱镉效果,能有效穿过细胞膜进入胞内。GMDTC对急性镉中毒具有较好的驱镉作用,可以大量降低肾镉,对镉的肾毒性有良好的保护作用,且GMDTC毒性低,经口LD50大于5000mg/Kg。镉主要通过慢性暴露在体内蓄积,使其引起慢性中毒的危害远大于急性中毒。前期研究表明,GMDTC对急性镉中毒具有较好的驱镉作用,且毒性低。但以往研究因给药剂量单一、动物样本量少、且性别单一等缺陷,不足以全面评价GMDTC的驱镉效果及其毒副作用。因此,本研究以GMDTC对慢性镉中毒的治疗为出发点,采用多个剂量、多种动物、两种性别以及多个时间点等因素全面地探讨GMDTC对慢性镉中毒的驱镉效果及其毒副作用。以慢性镉中毒小鼠和大鼠为对象,从两种动物身上探究GMDTC对慢性镉中毒的驱镉效果、其常规毒性、急性毒性,全面评价GMDTC治疗慢性镉中毒的疗效及毒副作用,并为GMDTC驱镉的下一步研究提供理论基础。方法1实验方法1.1 GMDTC治疗慢性镉中毒小鼠试验SPF级成年NIH小鼠120,雌雄各半,随机分为空白对照组和模型组。模型组小鼠采用多次腹腔注射0.6μmol/m L Cd Cl2+12μmol/m L ME混合液造模,1次/d,连续染毒5d,末次染毒结束后观察35d。随后将镉中毒模型组小鼠随机分为模型对照组、GMDTC低剂量组、GMDTC中剂量组、GMDTC高剂量组和EDTA治疗组,每组20只(雌雄各10只)。空白对照组及模型对照组均腹腔注射给予生理盐水;GMDTC治疗组分别给予108.3、216.5、433mg/Kg的GMDTC药物治疗;阳性药治疗组给予93.5mg/Kg的EDTA药物,1次/d,5d/周;雄性小鼠连续给药5周,雌性小鼠连续给药6周。1.2 GMDTC治疗慢性镉中毒大鼠试验SPF级成年SD大鼠60,雌雄各半,随机分为空白对照组和模型组。模型组动物采用多次腹腔注射0.3μmol/m L Cd Cl2+6μmol/m L ME混合液造模,1次/d,连续染毒5d,末次染毒结束后观察35d。随后将镉中毒模型大鼠随机分为模型对照组、GMDTC低剂量组、GMDTC中剂量组、GMDTC高剂量组和EDTA治疗组,每组10只(雌雄各5只)。空白对照组及模型对照组均腹腔注射给予生理盐水,GMDTC治疗组分别给予108.3、216.5、433mg/Kg的GMDTC药物治疗;阳性药治疗组给予93.5mg/Kg的EDTA药物,1次/d,5d/周;连续给药8周。1.3急性毒性试验急性经腹腔注射毒性试验采用上下法一次性腹腔注射给予0.51g/m L的GMDTC药液;急性经口毒性试验采用最大限量法一次性灌胃给予1.01g/m L的GMDTC药液。染毒后每天观察动物的中毒表现、死亡情况,连续观察14d,并分别在d0、d3、d7、d14称量体重。2统计分析实验数据以均数±标准差(sx±)表示,采用SPSS17.0软件进行方差齐性和单因素的方差分析(One Way ANOVA)。实验组与对照组的比较用Dunnett法,进一步作组间两两比较采用Bonferroni法,以P<0.05为检验水准。结果1 GMDTC对慢性镉中毒小、大鼠的驱镉效果1.1 GMDTC对慢性镉中毒小鼠驱镉效果GMDTC治疗慢性镉中毒小鼠后,GMDTC治疗组雄性小鼠肾脏Cd含量显著低于模型对照组和EDTA组(P<0.05),其驱镉率分别为23.8%、31.8%、47.9%;GMDTC中、高剂量组雌性小鼠肾脏Cd含量低于模型对照组和EDTA组(P<0.05),其驱镉率分别为11.2%、21.4%、41.7%。GMDTC治疗组小鼠24h尿Cd总含量高于模型对照组(P<0.05);治疗结束后24h尿Cd总含量明显高于造模结束后含量(P<0.05)。模型对照组及GMDTC治疗组雄性小鼠血Cd显著升高,且EDTA组明显高于模型对照组(P<0.05)。肝、脑及睾丸Cd含量无明显改变。提示,GMDTC治疗慢性镉中毒时,能促使肾脏内的镉经尿液排出体外,同时不引起Cd向其他脏器转移。1.2 GMDTC对慢性镉中毒大鼠的驱镉效果GMDTC治疗慢性镉中毒大鼠后,GMDTC治疗组肾脏Cd含量明显降低,且GMDTC高剂量组显著低于模型对照组(P<0.05);雄性大鼠肾脏的驱镉率分别为19.4、10.7和33.6;雌性大鼠肾脏驱镉率分别为18.2、12.5和32.9。GMDTC治疗组小鼠24h尿Cd总含量高于模型对照组(P<0.05);治疗结束后24h尿Cd总含量明显高于治疗前(P<0.05)。模型对照组及GMDTC治疗组雄性大鼠血Cd显著降低,雌性大鼠血Cd无差异。说明GMDTC治疗慢性镉中毒大鼠时,在不同剂量与性别之间均存在差异。1.3肝Cd、肾Cd、血Cd和尿Cd之间的相关性GMDTC治疗后,雄性小鼠肾Cd与肝Cd随GMDTC剂量的增加而降低,在GMDTC三个组间均呈正相关关系,相关系数分别为0.861、0.777和0.661。雌性小鼠的肾Cd与肝Cd不存在相关性。GMDTC治疗慢性镉中毒大鼠后,雄性大鼠肝Cd和肾Cd含量在三个剂量之间呈高、低、高趋势,但相关性不明显;雌性大鼠肝Cd和肾Cd含量在GMDTC中、高剂量之间均呈正相关关系(P<0.05)。24h尿Cd随GMDTC剂量的增加而升高,血Cd随GMDTC剂量的增变化不明显,与肾Cd均不存在相关性(P>0.05),而驱镉率则与肾镉含量均呈完全负相关关系(P<0.05)。2 GMDTC对小鼠和大鼠毒副作用2.1 GMDTC对小鼠和大鼠生长发育的影响GMDTC对小鼠体重增长无影响,而93.5mg/kg的EDTA轻微导致雌性小鼠体重增长降低(P<0.05);GMDTC对雌性大鼠体重增长无影响,而长期给予高剂量的GMDTC和EDTA可抑制雄性大鼠体重增长(P<0.05)。GMDTC对小鼠脏器重量影响很小,但中剂量的GMDTC对雌性小鼠脏器指数有影响。GMDTC治疗慢性镉中毒雄性小鼠后,中、高剂量组均出现10%小鼠肝脏病变和10%小鼠肾脏病变。镉中毒模型雌性小鼠50%出现肝脏病理改变,60%出现肾脏病理改变,而GMDTC治疗后肝脏和肾脏的病理改变均有所减轻。说明,Cd对雌雄小鼠肾脏的病理损伤不相同,相同剂量时雌性小鼠中毒程度较雄性严重,而GMDTC治疗能减轻镉中毒引起的改变。2.2 GMDTC对小鼠体内金属元素的影响GMDTC治疗慢性镉中毒雄性小鼠后,GMDTC高剂量组肾脏Ca、Cu、Zn含量高于空白和模型对照组(P<0.05)。GMDTC治疗慢性镉中毒雌性小鼠后,模型组和治疗组肾脏Ca含量略低于空白对照组(P<0.05);模型对照组血液Cu高于空白对照组(P<0.05),GMDTC高剂量组血液Cu低于模型对照组(P<0.05);模型对照组和GMDTC治疗组脑中Ca含量低于空白对照组;GMDTC高剂量组和EDTA组脑中Cu、Mg含量较空白对照和模型对照组降低;GMDTC高剂量组和EDTA组脑中Zn含量低于空白对照(P<0.05);模型对照组和治疗组肝脏中Ca含量均低于空白对照组(P<0.05);模型组肝脏中Cu含量低于空白对照组,而GMDTC高剂量组和EDTA组肝脏中Cu含量则高于模型对照(P<0.05)。说明,镉会引起小鼠脑组织和肝脏中Ca含量降低,而高剂量的GMDTC和EDTA对小鼠体内的Zn、Cu有轻微影响。3 GMDTC对小鼠和大鼠的急性毒性急性毒性试验采用上下法和最大限量法,经口灌胃和经腹腔注射均无大鼠死亡。依据化学药物急性毒性评价标准判断,认为GMDTC对小鼠和大鼠经口急性LD50均﹥10g/Kg;经腹腔注射急性LD50均﹥5g/Kg,其急性毒性分级属低毒或无毒。结论1 GMDTC对慢性镉中毒大鼠和小鼠的驱镉效果良好,促使肾镉经代谢从尿液循环排出体外,同时不引起体内镉向其他脏器转移。2 GMDTC对动物生长发育和金属元素影响不明显,对镉引起的肾损伤具有一定的保护作用,毒副作用小,。3 GMDTC对小鼠和大鼠经口急性LD50﹥10g/Kg;经腹腔注射急性LD50﹥5g/Kg,其急性毒性分级为低毒或实际无毒。