背景与目的:髓核退变是椎间盘退行性疾病的核心病理变化,由于人类直立行走以及椎间盘特殊的解剖结构特点,使得髓核细胞（NPCs）在人体内处于持续压应力、乏血供、以及高渗透压的复杂理化微环境中,导致髓核组织自身修复潜能较差。近年来随着生物材料与组织工程技术的飞速发展,为实现退变髓核组织再生修复带来了新的希望。但传统组织工程髓核（TE-NP）构筑存在诸如体外扩增培养的种子细胞功能胞外基质（ECM）合成能力差、应力微环境适应力弱、以及生物支架材料仿生性能不足等瓶颈问题,限制了基于组织工程策略的髓核组织再生修复效果。髓核组织作为缓冲脊柱所受压应力的关键组织结构,其发生、发育及退变过程均与压应力介导的调控机制密切相关。因此,本研究拟通过系统地阐述压应力对NPCs生物学行为的调控效应,并基于该效应的作用机制,探究增强种子细胞生物学活性及应力微环境适应性的TE-NP构筑新模式,为突破瓶颈、实现椎间盘退行性疾病的生物学治疗提供可行的组织工程策略及理论指导。方法:第一部分:本部分研究基于课题组自主研发的“智能化仿生机械压应力组织培育系统”,对接种于水凝胶生物支架上的三维培养大鼠NPCs施加引起不同水凝胶形变量的轴向动态机械压应力,观察不同负荷机械压应力对于NPCs衰老、凋亡的影响,并应用高通量测序技术及相关功能实验探究机械压调控NPCs生物学行为的潜在分子机制与途径。第二部分:本部分研究基于“智能化仿生静液压组织培育系统”,进一步对接种于水凝胶生物材料上的三维培养大鼠NPCs、以及离体兔椎间盘髓核组织施加不同压强的动态静液压,观察不同压强静液压对于NPCs活性及功能ECM代谢的生物学效应,并应用高通量测序技术及相关功能实验探究静液压调控NPCs生物学行为的潜在分子机制与途径。第三部分:基于前两部分压应力调控NPCs生物学行为的作用机制,我们推测通过增强NPCs间粘附作用,以调控低压应力微环境下ECM受体互作通路介导的功能ECM合成代谢或将提升用于TE-NP构筑的接种单元生物活性。因此,我们通过体外诱导NPCs悬浮自粘附形成髓核细胞微球（NPC spheroids）以强化细胞间粘附作用,进一步观察该培养模式下的NPCs的生物活性及功能ECM合成代谢,并通过高通量测序技术分析该培养模式下的NPC spheroids与传统体外平面培养扩增的孤立NPCs间差异基因及调控途径。第四部分:为了增强用于TE-NP构筑的生物支架材料在成分、结构、及力学性能上的仿生性,同时实现可注射式TE-NP微创化移植,我们采用天然脱细胞髓核基质（DNPM）作为水凝胶制备底物,通过甲基丙烯酸酐（MA）对DNPM胶原纤维侧链氨基进行酰化修饰,合成具备光响应性并保持了原有基质成分完整性的光交联DNPM-MA水凝胶,最大限度模拟天然基质成分对NPCs功能ECM合成代谢时空分布调控的同时,赋予水凝胶光响应交联特性及适宜的力学强度,以搭载接种单元进行可注射式TE-NP仿生构筑。第五部分:为验证以NPC spheroids作为接种单元的TE-NP构筑模式再生修复效果,我们在大鼠鼠尾椎间盘及兔腰椎间盘中构造髓核缺损模型,并将水凝胶搭载NPCs及NPC spheroids构筑的两种TE-NP分别移植入大鼠鼠尾间盘及兔腰椎间盘髓核腔中,通过影像学和组织学分析评价髓核组织再生修复效果,并对前三部分研究得出的潜在作用机制进行动物体内验证。结果:第一部分:引起5%形变量的低负荷机械压应力可维持NPCs正常活性、表型、及功能ECM稳态;而引起≧10%形变量的高负荷机械压应力将诱发NPCs衰老表型及凋亡,加剧功能ECM分解代谢;高负荷机械压应力可通过引起NPCs内氧化应激损伤介导的线粒体功能稳态失常,导致细胞衰老及凋亡样命运改变,继而诱发和加剧髓核退变。第二部分:0.5 MPa低负荷静液压可维持NPCs正常活性,并相较于无应力对照组表现出更强的促功能ECM合成能力;而≧0.8 MPa静液压可降低NPCs活性,继而抑制功能ECM合成代谢;静液压对于髓核生物学功能的调控机制与ECM受体相关蛋白N-CDH与ITGβ1互作介导的信号通路调控NPCs活性及功能ECM代谢相关。第三部分:N-CDH与ITGβ1互作介导细胞间粘附作用在低压应力促进髓核功能ECM合成代谢过程中发挥了重要调控作用。基于该调控机制,我们应用细胞三维悬浮培养技术强化NPCs间粘附作用形成NPC spheroids,通过与孤立NPCs对比,发现NPC spheroids具有更强的功能ECM合成能力以及低负荷压应力生物学效应“窗”响应性。第四部分:通过对DNPM进行酰化修饰合成出了具有光交联特性的DNPM-MA水凝胶,并经力学性能检测、细胞相容性检测、组织相容性检测等性能评价,筛选出浓度为10%的DNPM-MA水凝胶可作为构筑可注射式TE-NP的仿生基质材料。第五部分:DNPM-MA水凝胶搭载NPCs或NPC spheroids的两种TE-NP移植后,相较于髓核缺损组和空载水凝胶移植组在动物体内实验中均表现出了一定程度的再生修复效果,且基于NPC spheroids构筑的TE-NP相较于基于NPCs构筑的TE-NP在影像学和组织学上均表现出更优的髓核再生修复效果。结论:压应力对于NPCs生物学行为具有“窗”效应,在高负荷压应力下,NPCs发生氧化应激损伤及线粒体功能稳态失常并诱发细胞衰老、凋亡样命运改变,加剧髓核功能ECM分解及退变进展;而低负荷压应力可通过调控ECM受体N-CDH与ITGβ1互作增强NPCs间粘附作用,继而促进功能ECM合成代谢;在上述调控机制指导下,通过三维悬浮培养模式培育NPC spheroids以强化细胞间粘附作用,可增强细胞活性、力学微环境适应性、以及功能ECM分泌;以NPC spheroids替代孤立NPCs作为接种单元,应用基于天然DNPM的具备构成成分和力学性能双重仿生的光交联水凝胶为支架材料“自下而上”构筑可注射式TE-NP。该模式相较于传统的以孤立NPCs为接种单元的TE-NP构筑模式表现出更强的髓核组织再生修复效果,拓展了基于微尺度组织工程技术的TE-NP构筑在椎间盘退行性疾病生物学治疗中的应用前景。