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研究目的:通过研究人羊膜间充质干细胞(Human amniotic mesenchymal stem cell,HAMSC)在不同条件下促进骨质新生的作用及相关机制,为组织工程骨提供新的种子细胞,并为骨组织工程骨再生修复不同诱因导致的骨缺损提供理论和实验依据。研究方法:通过收集废弃的人胎盘组织上羊膜层,分离、获取羊膜间充质干细胞;通过购买获取人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells,HBMSC),进行干细胞表面标记物初步鉴定后,选取第3-6代细胞用于后续实验。首先,通过Transwell小室构建HAMSC/HBMSC非接触式共培养体系;通过细胞周期以及EdU染色检测HAMSC对HBMSC在增殖方面的作用;通过碱性磷酸酶活性测定、茜素红染色及定量PCR检测HAMSC对HBMSC在成骨相关指标上的作用;通过Western-blot检测HAMSC对HBMSC在成骨相关蛋白表达上的作用及相应的通路机制。在此基础上,利用双氧水构建HBMSC氧化应激损伤模型;通过Transwell小室构建HAMSC/氧化应激损伤HBMSC非接触式共培养体系;通过细胞周期以及EdU染色检测HAMSC对氧化应激损伤HBMSC在增殖方面的作用;通过流式细胞技术及激光共聚焦染色检测HAMSC对氧化应激损伤HBMSC中活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)含量的影响;通过碱性磷酸酶活性测定以及茜素红染色检测HAMSC对氧化应激损伤HBMSC在成骨相关指标上的作用;通过Western-blot以及流式细胞技术检测HAMSC对氧化应激损伤HBMSC在成骨相关蛋白表达上的作用及相应的通路机制。最后,利用脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)构建HBMSC炎症损伤模型;通过Transwell小室构建HAMSC/炎症损伤HBMSC非接触式共培养体系;通过细胞周期以及EdU染色检测HAMSC对炎症损伤HBMSC在增殖方面的作用;通过碱性磷酸酶活性测定、茜素红染色、Western-blot、定量PCR以及流式细胞技术,检测HAMSC对炎症损伤时HBMSC在成骨相关指标表达上的作用及相应的通路机制;通过流式细胞技术及总超氧化物歧化酶活性测定检测HAMSC对炎症损伤HBMSC中氧化应激水平的影响。实验结果:所分离、提取的HAMSC为贴壁生长的成纤维样细胞,通过流式细胞术进行干细胞表面标记物鉴定,证明细胞为间充质来源。首先,我们发现在非接触式共培养体系中,HAMSC不仅对HBMSC的增殖有促进作用,而且能够促进HBMSC向成骨方向分化,其中的相关机制与HBMSC中的Erkl/2 MAPK通路被HAMSC激活有关。在此基础上,我们进一步发现HAMSC可以促进氧化应激损伤HBMSC的增殖以及向成骨方向分化,HAMSC还显著降低了氧化应激损伤HBMSC中ROS水平,其中的相关机制与氧化应激损伤HBMSC中的Erk1/2 MAPK通路被HAMSC激活有关。最后,我们发现HAMSC可以促进炎症损伤HBMSC的增殖以及向成骨方向分化,HAMSC还显著降低了炎症损伤HBMSC中的氧化应激水平,其中的相关机制与炎症损伤HBMSC中的p38 MAPK通路被HAMSC激活有关。结论:成功提取HAMSC,通过实验证明HAMSC在修复不同诱因导致的骨缺损方面具有明显优势,并明确了其中的相关机制。研究表明HAMSC是一种骨组织工程中理想的种子细胞。