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研究背景子痫前期（Preeclampsia,PE）是一种主要以妇女正常妊娠20周后出现高血压与蛋白尿,或无蛋白尿伴有靶器官损害症状为特征的妊娠期特有疾病,影响全球5%至10%的妊娠,是围产期孕妇和胎儿发病或死亡的主要原因之一。虽然有大量关于PE发病机制的研究,但其机制目前仍不完全清楚。PE的临床症状随胎盘异常发育而出现,在胎盘娩出后迅速消失,表明胎盘因素在PE发病中发挥重要作用。目前母体子宫螺旋动脉滋养细胞侵入不足导致的胎盘浅着床是公认的PE主要发病机制之一,与胎盘组织绒毛外滋养细胞的增殖、迁移和侵袭功能异常相关。本课题组前期研究发现多个Wnt信号通路配体基因在PE胎盘组织中的表达改变,其改变通过影响绒毛外滋养细胞的增殖、迁移和侵袭功能参与胎盘浅着床的过程。国内外也有大量文献报道Wnt信号通路配体参与PE的发生发展,但鲜有文献讨论导致这些Wnt信号通路配体基因异常表达的原因。DNA甲基化是影响基因表达的重要因素,分析Wnt信号通路相关配体的DNA甲基化改变,可为阐明Wnt信号通路在PE中的作用提供更多的理论支持。目的分析Wnt信号通路所有配体在PE胎盘中的DNA甲基化水平变化,寻找与PE相关的DNA甲基化显著改变的Wnt信号通路配体,从DNA甲基化方面研究Wnt信号通路参与PE发生发展的机制。材料与方法1研究对象临床样本:选取30例早发型子痫前期患者胎盘组织作为子痫前期（Preeclampsia）组（PE组）、30例特发性早产（Preterm）胎盘组织作为早产组（PB组）,30例足月正常产（Term birth）胎盘组织作为正常组（TB组）。PB组发生早产的病因限于羊水过少和宫颈功能不全,排除感染、胎膜早破等所致的早产。选取每组中的4例进行DNA甲基化芯片检测,其中PE组和PB组均选取33+0-34+6分娩的孕妇胎盘组织。本研究经郑州大学第三附属医院伦理委员会批准,获取标本时均取得患者的知情同意。细胞样本:选取早期人绒毛外滋养层细胞HTR-8/SVneo细胞系和人胎盘绒毛膜癌细胞JAR细胞系用于细胞实验。2实验方法2.1胎盘组织标本的采集在孕妇剖宫产后15分钟内获取胎盘组织。去掉胎膜后从母体侧的子叶中剥离胎盘绒毛组织,获得的组织没有可见的梗死、钙化、血肿或撕裂,PBS洗去收集的胎盘组织表面的血液,剪取0.5cm×0.5cm×0.5cm大小组织放入冻存管,放置于液氮中10分钟后,保存在-80℃冰箱备用。2.2 Wnt信号通路配体的DNA甲基化谱分析选取PE组、PB组和TB组胎盘组织各4例进行Infinium Human Methylation850K Beadchip全基因DNA甲基化检测,对结果中的28个Wnt信号通路配体基因的DNA甲基化水平进行分析。以P＜0.05和|Δβ|≥0.10为标准,筛选甲基化水平差异显著的Wnt信号通路配体基因。2.3甲基化差异显著基因的甲基化水平验证对筛选出的DNA甲基化差异显著的基因（WNT3）进行焦磷酸测序验证,参照850K芯片中的甲基化位点设计引物,生物素对反向引物的5’末端进行标记。对重亚硫酸盐转化后的胎盘组织DNA进行检测,验证甲基化芯片筛选出的差异甲基化基因WNT3在三组胎盘组织中的DNA甲基化变化水平。2.4甲基化差异显著的基因m RNA表达分析将提取好的组织和细胞的RNA逆转录为c DNA,然后使用荧光定量PCR法检测差异甲基化基因WNT3 m RNA表达水平。2.5胎盘组织中蛋白质表达分析Western blot检测蛋白质在组织和细胞中的表达,包括WNT3蛋白及其下游蛋白β-catenin、磷酸化β-catenin、GSK3β、磷酸化GSK3β和内参蛋白的表达水平。采用免疫组织化学方法分析WNT3蛋白在胎盘组织中的定位。2.6细胞培养HTR-8/SVneo和JAR细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM中培养,放置于环境为37℃和5%CO2的培养箱中。2.7 DNA甲基转移酶抑制剂处理细胞HTR-8/SVneo和JAR细胞贴壁良好后将培养基改为含有5μM5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-d C）的新鲜培养基,此后每天更换直至细胞长满培养瓶,对照组用0.1‰DMSO处理,然后检测WNT3 m RNA的表达水平。2.8细胞中蛋白质表达分析将设计好的短发夹RNA（Short hairpin RNA,sh RNA）转染至状态良好的HTR-8/SVneo细胞中作为实验组（sh-WNT3）,设计转染一个无关的序列为阴性对照组（sh-NC）和未进行任何处理的空白对照组。转染48小时后检测转染效率。Western blot检测三组细胞中WNT3、β-catenin、磷酸化β-catenin、GSK3β、磷酸化GSK3β和内参蛋白的表达水平。2.9细胞增殖能力分析使用细胞计数试剂盒（CCK-8）来测定三组细胞的增殖能力,用酶标仪在450nm处获得每组细胞的吸收值。3统计学分析采用SPSS 23.0和Graph Pad Prism 8.4.2进行统计分析。符合正态分布的定量数据以平均值±标准差表示,两组间比较采用Student’s t检验,三组间比较采用one-way ANOVA。采用Pearson相关分析对两个连续变量之间相关性进行分析。以α=0.05为检验水准。结果1早发型子痫前期胎盘组织中Wnt信号通路配体基因甲基化水平1.1 TB、PB和PE三组孕妇的临床特征本研究中PE组和PB组孕妇的分娩孕周无明显差异,但均明显低于TB组（P＜0.05）。PE组孕妇的收缩压、舒张压和尿蛋白定量明显高于TB组和PB组（P＜0.05）,而TB组和PB组孕妇之间无统计学意义。PE组和PB组孕妇的胎儿的出生体重明显低于TB组（P＜0.05）,PE组的胎儿出生体重又明显低于PB组（P＜0.05）。三组间的孕妇分娩年龄和新生儿性别均无统计学差异。选取每组中的4例用于甲基化芯片分析,选取的PE和PB组孕妇分娩孕周均在33+0-34+6周。1.2 Wnt信号通路配体基因DNA甲基化水平对全基因组甲基化芯片中的28个Wnt信号通路配体基因进行分析。PE组与TB组相比,共有59个差异甲基化位点（P＜0.05）,涉及22个基因。PE组与PB组比,共有34个差异甲基化位点（P＜0.05）,涉及19个基因。PB组与TB组比,共有228个差异甲基化位点（P＜0.05）9,涉及26个基因。聚类分析所得的热图显示PE组Wnt信号通路配体基因的整体甲基化水平高于TB组,低于PB组。综上可见孕周是导致DNA甲基化差异的重要原因。随后在孕周无差异的PE组和PB组之间挑选甲基化差异显著的基因。28个基因中只有WNT3基因符合筛选标准。扩大样本量后采用焦磷酸测序确认PE组WNT3基因DNA甲基化水平显著低于PB组和TB组。1.3胎盘组织中WNT3基因表达水平和Wnt/β-catenin信号通路活性经q RT-PCR验证,PE组m RNA的表达水平显著高于TB组和PB组,且WNT3 m RNA表达水平与其DNA甲基化水平呈负相关（r=-0.525,P＜0.05）。Western blot显示WNT3蛋白在PE胎盘组织中的表达水平明显高于TB组和PB组,而TB组和PB组之间没有统计学差异。免疫组织化学结果显示WNT3蛋白定位于胎盘组织的绒毛滋养细胞（Villous trophoblasts,VTs）和绒毛外滋养细胞（Extravillous trophoblasts,EVTs）,且PE胎盘组织VTs和EVTs中WNT3蛋白水平均高于其他两组。PE组的磷酸化β-catenin蛋白和β-catenin蛋白的比值也明显高于其他两组,而磷酸化GSK3β蛋白和GSK3β蛋白的比值明显低于其他两组,PE组Wnt/β-catenin信号通路活性下降。2 WNT3基因对人绒毛外滋养细胞增殖能力的影响2.1 DNA甲基转移酶抑制剂处理促进WNT3的表达DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-d C处理体外培养的HTR-8/SVneo细胞和JAR细胞后WNT3 m RNA表达明显增高。2.2沉默WNT3基因后细胞中Wnt/β-catenin信号通路的活性降低Western blot结果显示沉默WNT3基因的sh-WNT3组细胞中WNT3蛋白的表达水平明显低于sh-NC组和空白对照组。sh-WNT3组的磷酸化β-catenin蛋白和β-catenin蛋白的比值也明显高于其他两组,而磷酸化GSK3β蛋白和GSK3β蛋白的比值明显低于sh-NC组和空白对照组,sh-WNT3组细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性降低。2.3沉默WNT3基因抑制细胞的增殖能力sh-WNT3组细胞的增殖能力明显低于sh-NC组和空白对照组。结论WNT3基因在早发型子痫前期中呈现高表达状态,与其DNA甲基化水平下降相关。绒毛外滋养细胞中沉默WNT3基因后Wnt/β-catenin信号通路活性下降,细胞增殖能力下降,符合WNT3蛋白作为Wnt/β-catenin信号配体的功能,与其他经典WNT配体一致。