近视是眼科的常见病、多发病,影响患者的学习、工作和生活,其发病率逐年上升,已经成为严重的医学社会问题。因此,近视的发病机制及其防治已成为全球关注的热点。随着分子生物学技术的发展,大量研究提示：异常视觉信息引起眼内多种生长因子及神经递质发生改变,通过一系列的信号转导过程,导致巩膜细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过多降解,巩膜重塑,眼轴延长,形成近视。研究证实,近视形成过程中,巩膜基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)表达明显增强。MMP-2是降解巩膜ECM最主要的酶,MMP-2表达增高极可能是近视眼中巩膜重塑的直接原因。但MMP-2表达增高的具体原因尚不清楚。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一种多功能的生长因子,其受体c-Met由原癌基因c-met编码,具有酪氨酸激酶活性。HGF及其受体c-Met存在于多种组织和细胞中。HGF与其受体c-Met结合后,可激活c-Met发生自体磷酸化,启动下游信号转导通路的级联激活,从而调节多种组织器官的生长发育及多种病理过程。近年来大量研究显示,HGF可在多种组织及细胞上调MMP-2的表达,导致ECM降解,发挥其抗纤维化的作用。最近,在小鼠眼球生长基因研究中发现,HGF相关基因可能与眼球生长密切相关。而眼球的生长与近视形成有密切的关系,因此我们推测：HGF可能与近视的形成有关。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)家族是1990年被发现的促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase, MAPK)超家族成员之一,是成纤维细胞等细胞中多种信号从细胞表面向核内传递的共同途径,属于进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。以JNK为中心的JNK信号转导通路可被生长因子、细胞因子及环境应激等刺激信号激活,从而调控下游基因的转录,在多种疾病的发生发展中起重要的作用。最近研究显示,JNK信号转导通路可介导多种组织及细胞内MMP-2的表达增强,促进ECM降解,发挥抗纤维化等作用。巩膜组织及细胞中有否HGF及c-Met的表达?近视眼巩膜中HGF及c-Met表达是否增强?HGF能否上调巩膜中MMP-2的表达?如果能,是通过JNK信号转导通路的介导吗?目前国内外文献中尚未见相关报道。研究建立豚鼠透镜诱导性近视模型,培养豚鼠巩膜成纤维细胞,检测近视形成过程中HGF及MMP-2的表达变化；在体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞中，观察HGF能否上调MMP-2的表达及JNK信号转导通路在HGF上调MMP-2表达中的作用；玻璃体腔注射JNK信号转导通路的特异性抑制剂SP600125,观察其是否能抑制豚鼠透镜诱导性近视的形成,从而探讨HGF-JNK-MMP-2信号途径在近视形成中的作用,为近视的防治提供新的思路。课题分以下3部分。第一部分肝细胞生长因子在豚鼠透镜诱导性近视眼的表达目的建立豚鼠透镜诱导性近视模型,应用免疫组织化学、Western blot及RT-PCR方法检测正常对照组及透镜诱导组巩膜中HGF、c-Met及MMP-2的mRNA及蛋白表达,以探讨HGF与近视形成的关系。方法1.动物模型的建立及分组：选用健康1周龄雄性花色豚鼠90只,随机分为正常对照组和透镜诱导组。对照组：30只豚鼠的双眼不作任何处理,共60眼。透镜诱导组：60只豚鼠的右眼,眼前配戴-10.0D透镜,共60眼。6周后,每组取20眼用于HE染色及免疫组化检测,20眼用于RT-PCR检测,另20眼用于Western blot方法检测。2.屈光度与眼轴长度测量：实验前后以检影镜检测豚鼠屈光状态,眼科A超测量眼轴长度。3. HE染色与形态学观察：光学显微镜下观察正常对照组及透镜诱导组的形态学变化。4.免疫组化染色方法：检测正常对照组及透镜诱导组巩膜中HGF、c-Met及MMP-2的蛋白表达。5.RT-PCR方法：检测正常对照组及透镜诱导组巩膜中HGF、c-Met及MMP-2的mRNA表达。6. Western blot方法：检测正常对照组及透镜诱导组巩膜中HGF、c-Met、p-c-Met及MMP-2的蛋白表达。7.统计学分析：所有数据均用x±s表示,统计学处理应用SPSS13.0统计软件,2组间比较采用配对t检验,眼轴长度与屈光度关系采用直线相关分析,取α=0.05作为检验水准。结果1.屈光度与眼轴长度：与正常对照组比较,透镜诱导组形成了明显近视：负屈光度明显增加(P＜0.05),眼轴明显增长(P＜0.05)。2.形态学变化：透镜诱导组视网膜、脉络膜及巩膜均变薄,巩膜胶原纤维变薄、排列稀疏、紊乱。3.免疫组化染色检测：正常对照组巩膜中可检测到HGF、c-Met及MMP-2蛋白呈低水平表达,巩膜轻度着染呈淡黄色；透镜诱导组巩膜中HGF、MMP-2蛋白表达较正常对照组明显增强(P＜0.05),巩膜组织着色呈棕黄色,2组中c-Met蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4. RT-PCR方法检测：正常对照组巩膜中可检测到HGF、c-Met及MMP-2mRNA低水平表达；透镜诱导组巩膜中HGF及MMP-2 mRNA表达较正常对照组明显增强(P＜0.05),而c-Met mRNA表达在2组中比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。5. Western blot方法检测：正常对照组巩膜中可检测到HGF、c-Met及MMP-2蛋白低水平表达,透镜诱导组巩膜中HGF、MMP-2蛋白表达较正常对照组明显增强(P＜0.05)。2组中总的c-Met蛋白表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05),但在透镜诱导组中p-c-Met蛋白表达明显增强(P＜0.05)。6. HGF. p-c-Met及MMP-2蛋白在透镜诱导组巩膜中表达的相关性分析：在透镜诱导组巩膜中,HGF与p-c-Met, p-c-Met与MMP-2及HGF与MMP-2蛋白表达的相关系数分别是0.902,0.885,0.900,P均＜0.05,提示三者的蛋白表达两两相关。结论1.透镜诱导组巩膜中,HGF表达增加,其受体c-Met磷酸化增强,提示：HGF可能参与透镜诱导性近视的形成。2.透镜诱导组巩膜中,HGF、p-c-Met及MMP-2的蛋白表达增强且两两正相关,提示：HGF可能通过上调MMP-2的表达参与透镜诱导性近视形成。第二部分HGF调控豚鼠巩膜成纤维细胞MMP-2表达的体外研究目的实验前期研究发现,HGF可能通过上调MMP-2表达参与透镜诱导性近视的形成和发展。进一步培养正常对照组及透镜诱导组豚鼠巩膜成纤维细胞,在体外检测2组细胞中HGF、c-Met及MMP-2蛋白表达；用HGF及其siRNA处理巩膜成纤维细胞,检测MMP-2的mRNA及蛋白表达；并观察JNK信号转导通路在HGF调控MMP-2表达中的作用。从而探讨HGF-JNK-MMP-2信号途径在近视形成中的作用。方法1.培养正常对照组和透镜诱导组巩膜成纤维细胞：将30只1周龄雄性花色豚鼠随机分为正常对照组和透镜诱导组。对照组：10只豚鼠的双眼不作任何处理,共20眼。透镜诱导组：20只豚鼠的右眼,眼前配戴-10.OD透镜,共20眼。4周后,处死豚鼠,体外培养正常对照组和透镜诱导组巩膜成纤维细胞,观察细胞形态,并鉴定细胞类型。2.免疫细胞化学染色方法及Western blot方法检测正常对照组和透镜诱导组巩膜成纤维细胞中HGF、c-Met及MMP-2的蛋白表达。3.探讨在体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞中,MMP-2是否为HGF的直接靶基因：3.1 MTT法检测不同浓度(0.1 ng/ml、1ng/ml、10ng/ml)的HGF对正常对照组巩膜成纤维细胞增殖的影响。3.2上述不同浓度的HGF作用于正常对照组巩膜成纤维细胞,Western blot方法检测细胞中p-c-Met的蛋白表达,RT-PCR及Western blot方法检测MMP-2的mRNA及蛋白表达。选取不明显影响巩膜成纤维细胞增殖、上调MMP-2表达作用明显的HGF的浓度为10ng/ml,用于后续实验。3.3鉴于透镜诱导组巩膜成纤维细胞中内源性HGF基因表达较高,我们选择其用于HGFsiRNA转染。在透镜诱导组巩膜成纤维细胞中转染HGF siRNA, Western blot方法检测HGF蛋白表达,RT-PCR及Western blot方法检测MMP-2 mRNA及蛋白表达。4.探讨在体外培养豚鼠巩膜成纤维细胞中,HGF上调MMP-2的表达是否通过JNK信号转导通路介导：4.1 HGF (10ng/ml)作用于正常对照组巩膜成纤维细胞,Western blot方法检测JNK信号转导通路的状态及MMP-2蛋白表达的变化。4.2 MTT法检测不同浓度(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)的SP600125对正常对照组巩膜成纤维细胞增殖的影响,选取10μmol/L为最佳浓度,用于后续实验。4.3 SP600125 (10μmol/L)预处理后,HGF(10ng/ml)作用于正常对照组巩膜成纤维细胞,Western blot方法检测JNK信号转导通路的状态及MMP-2蛋白表达的变化。5.统计学分析：所有数据均用x±s表示,统计学处理应用SPSS13.0统计软件,2组间比较采用配对t检验,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,取α=0.05作为检验水准。结果1.培养的正常对照组和透镜诱导组巩膜成纤维细胞生长良好,光镜下观察形态差异不明显。2组细胞均表达波形蛋白,而不表达角蛋白,表明所培养细胞确实为成纤维细胞。2. 2组巩膜成纤维细胞中HGF、c-Met及MMP-2的蛋白表达：2.1免疫细胞化学染色方法：正常对照组巩膜成纤维细胞中可检测到HGF、c-Met及MMP-2蛋白低水平表达,胞浆呈淡黄色着色；透镜诱导组巩膜成纤维细胞中HGF、MMP-2蛋白表达较正常对照组明显增强(P＜0.05),胞浆呈棕黄色着色,2组细胞总c-Met蛋白表达Mol/L(P＞0.05)。2.2 Western blot方法检测：正常对照组巩膜成纤维细胞中可检测到HGF、c-Met及MMP-2蛋白低水平表达；透镜诱导组巩膜成纤维细胞中HGF、MMP-2蛋白表达较正常对照组明显增强(P＜0.05)；2组细胞总c-Met蛋白表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05),但透镜诱导组巩膜成纤维细胞中c-Met蛋白磷酸化明显增强(P＜0.05)。3.在体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞中：3.1不同浓度的HGF(0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml)对正常对照组巩膜成纤维细胞干预72h后未见促进或抑制增殖能力的作用,与空白对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)3.2在正常对照组巩膜成纤维细胞中,HGF以剂量依赖的方式上调p-c-Met蛋白表达,随后以剂量依赖的方式上调MMP-2的mRNA及蛋白表达,各组间两两比较,差异有统计学意义(P＜0.05)3.3在透镜诱导组巩膜成纤维细胞中转染HGF siRNA, HGF siRNA以时间依赖的方式抑制HGF蛋白表达,与空白对照组比较,72h后HGF蛋白表达明显下降(P＜0.05),同时MMP-2的mRNA及蛋白表达也明显下降(P＜0.05)4.在体外培养的豚鼠正常对照组巩膜成纤维细胞中：4.1 HGF (10ng/ml)可以激活细胞中JNK信号转导通路,诱导JNK磷酸化增强,继而引起MMP-2蛋白表达明显上调(P＜0.05)。4.2不同浓度的SP600125干预细胞72h后,未表现出明显促进或抑制增殖能力的作用,与空白对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。4.3用SP600125(10μmol/L)预处理细胞后,HGF(10ng/ml)作用引起的JNK磷酸化和MMP-2蛋白表达上调均被明显抑制(P＜0.05)。结论1.透镜诱导导致豚鼠巩膜成纤维细胞内新的HGF蛋白合成以及MMP-2蛋白表达上调。2.在体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞中,HGF上调MMP-2的表达。3.在体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞中,HGF上调MMP-2的表达是通过JNK信号转导通路来实现的。提示,HGF可能通过HGF-JNK-MMP-2信号途径参与豚鼠透镜诱导性近视形成。第三部分：SP600125阻断豚鼠透镜诱导性近视巩膜中JNK信号转导通路的研究目的为了进一步在体内探讨近视巩膜中SP600125对JNK信号转导通路及近视形成的抑制作用,研究首先建立豚鼠透镜诱导性近视模型,采用玻璃体腔注射给药的方式,进一步明确JNK信号转导通路在近视形成中的作用及SP600125对近视的抑制作用。方法1.动物模型的建立与分组：选用健康1周龄雄性花色豚鼠70只,随机分成4组：Ⅰ组(透镜诱导6周组)、Ⅱ组.(透镜诱导6周+PBS组)、Ⅲ组(透镜诱导6周+SP600125(10μmol/L)组)、Ⅳ组(正常对照组)。正常对照组10只豚鼠,取双眼20眼为实验眼；余每组20只豚鼠,均以右眼为实验眼。2.屈光度及眼轴长度测量：同第1部分3. HE染色与形态学观察：同第2部分4. Western blot方法：检测各组豚鼠巩膜组织中p-JNK和MMP-2的蛋白表达。5.统计学分析：同第1部分结果1.屈光度及眼轴长度：Ⅰ组形成明显的高度近视,负屈光度及眼轴长度均较Ⅳ组明显增加(P均＜0.05),Ⅲ组能部分抑制上述改变,而Ⅱ组则无明显抑制作用。表明,SP600125(10μmol/L)部分抑制异常视觉信号引起的近视形成。2. HE染色与形态学观察：Ⅰ组与Ⅳ组比较,后极部巩膜明显变薄,Ⅲ组能部分抑制上述巩膜的改变,而Ⅱ组则无明显抑制作用。3. Western blot方法检测：Ⅰ组巩膜组织p-JNK及MMP-2的蛋白表达较Ⅳ组明显增强(P＜0.05),Ⅲ组能部分抑制上述改变,而Ⅱ组则无明显抑制作用。表明,SP600125部分抑制了异常视觉信号引起的p-JNK及MMP-2的蛋白表达。结论JNK信号转导通路的抑制剂SP600125可能具有抑制近视的作用。