骨骼是恶性肿瘤最常见的转移部位，约70%～80%的肿瘤患者最终会发生骨转移。骨转移瘤分为溶骨性和成骨性两类。溶骨性骨转移瘤使病变局部骨重吸收加剧，骨质遭到严重破坏，常引起顽固性骨痛、病理性骨折、高钙血症、脊髓压迫等并发症，严重降低肿瘤患者生活质量，缩短患者的生存时间。化疗是治疗骨转移瘤的重要手段，但是肿瘤发生骨转移时，往往对化疗药物具有明显的耐药性。另外由于骨组织结构特殊，化疗药物在骨组织中的渗透性差，一般的给药方法很难在骨肿瘤部位达到有效的治疗浓度，导致化疗效果不佳并加剧耐药。　　研究表明，溶骨性骨转移瘤生长时，所产生的细胞因子能够激活破骨细胞，使骨重吸收加重，导致骨质遭到严重破坏，增加了骨基质中释放出来的各种生长因子，促进了肿瘤生长，形成肿瘤生长与骨重吸收之间的恶性循环。因此，对于溶骨性骨转移瘤的治疗，不仅要抑制耐药肿瘤生长，还要抑制骨重吸收，彻底阻断耐药骨转移瘤生长与骨重吸收之间的相互诱导激活作用。　　目的：　　本研究分别以阿仑膦酸钠（ALN）、透明质酸（HA）为骨靶向和肿瘤细胞靶向材料，以普朗尼克P123（Pluronic）为递药载体，构建负载多西他赛（DTX）的骨转移瘤靶向胶束。该胶束具有骨靶向特性，选择性地蓄积在骨转移瘤部位；在溶骨性骨转移瘤局部，胶束脱落骨靶向材料ALN，不仅可发挥抗骨重吸收作用，而且也解除了骨基质对胶束的吸附；解除骨吸附后的胶束高效进入骨转移瘤细胞，并释放出DTX，抑制肿瘤生长，双向阻断骨转移瘤生长与骨重吸收之间的恶性循环，提高对骨转移瘤的治疗效果。　　方法：　　1.合成pH敏感和还原响应的胶束材料ALN-HA6k-Pluronic和ALN-HA32k-Pluronic，并采用核磁共振氢谱（1H NMR）和质谱（MS）对其结构进行表征。　　2.通过透析法制备负载DTX的骨靶向胶束，并对制备处方工艺进行优化。　　3.通过测定粒径、zeta电位、载药量、释药曲线、稳定性和溶血性对载药胶束进行表征。　　4.采用活体成像考察羟基磷灰石以及仔鼠颅骨组织对载药胶束的吸附作用，以及载药胶束从羟基磷灰石和仔鼠颅骨组织中的解吸附特性。　　5.培育耐DTX乳腺癌MDA-MB-231的细胞（MDA-MB-231/DDR细胞）和耐DTX前列腺癌PC-3细胞（PC-3/DDR细胞），通过MTT法考察载药胶束对PC-3细胞、PC-3/DDR细胞、MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231/DDR细胞的细胞毒性；通过激光共聚焦显微镜考察PC-3、PC-3/DDR、MDA-MB-231和MDA-MB-231/DDR细胞对Cy7.5标记的载药胶束的摄取；通过western blot法检测给药后PC-3、PC-3/DDR、MDA-MB-231和MDA-MB-231/DDR细胞中P-gp、bcl-2、bax、cleaved caspase-3等蛋白的表达。　　6.通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察载药胶束对RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响。　　7.采用新生小鼠颅骨组织和PC-3、PC-3/DDR、MDA-MB-231、MDA-MB-231/DDR细胞共孵育建立骨转移瘤体外3D模型，通过SEM考察载药胶束对3D模型中肿瘤细胞及骨重吸收的影响；通过TRAP和甲基绿（MG）染色观察载药胶束对3D模型中破骨细胞形成的影响。　　8.采用裸鼠后肢骨髓腔注射肿瘤细胞构建骨转移瘤裸鼠模型，通过测量裸鼠肿瘤体积评价载药胶束的体内抗肿瘤活性；利用活体成像仪考察载药胶束在荷瘤裸鼠体内的分布；通过micro-CT考察载药胶束对荷瘤裸鼠骨转移瘤处骨质的影响；通过H&E染色评价载药胶束的体内毒性；通过western blot法检测荷瘤裸鼠给药后肿瘤组织中P-gp、bcl-2、bax、cleaved caspase-3、NF-κB、OPG、RANKL、TGFβ1等蛋白的表达情况。　　结果：　　1.通过1H NMR和MS确定所合成的化合物为目标化合物。　　2.采用透析法制备了载药交联胶束DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic和DTX@ALN-(HA32k)CL-Pluronic。制备交联胶束的最优条件：温度为80℃，溶剂为去离子水和DMSO（v∶v=1∶1），药物与材料的投量比为3∶10（mg/mg）。DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic平均粒径为148nm，平均zeta电位为-6.63mV，平均载药量为10.6%（mg/mg）。DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic平均粒径为196nm，平均zeta电位为-8.59mV，平均载药量为11.2%（mg/mg）。SEM和TEM结果显示载药胶束呈球形且无聚集现象。　　3.体外释药结果显示，随着体外释放介质pH的降低，DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic和DTX@ALN-(HA32k)CL-Pluronic的释药速度加快，累积释药量增加。随着体外释放介质谷胱甘肽（GSH）浓度升高，DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic和DTX@ALN-(HA32k)CL-Pluronic的累积释药量显著增多。上述结果表明载药胶束体外释药具有pH响应性和还原响应性。　　4.羟基磷灰石和仔鼠颅骨组织对DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic和DTX@ALN-(HA32k)CL-Pluronic具有较强的吸附作用。在pH5.0条件下，DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic和DTX@ALN-(HA32k)CL-Pluronic可以快速从羟基磷灰石和仔鼠颅骨组织脱落。上述结果说明载药胶束具有良好的骨组织亲和力，而且在骨重吸收部位的弱酸性微环境中，可从骨基质中解吸附。　　5.耐DTX肿瘤细胞PC-3/DDR和MDA-MB-231/DDR对游离DTX具有明显的耐药性，DTX对耐DTX肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC50）是不耐药肿瘤细胞的10倍以上。与游离DTX相比，载药胶束对PC-3细胞、MDA-MB-231细胞、PC-3/DDR细胞和MDA-MB-231/DDR细胞的毒性明显提高，且DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic的细胞毒性高于DTX@ALN-(HA32k)CL-Pluronic。耐DTX肿瘤细胞对胶束的摄取具有明显的时间依赖性。　　6.骨转移瘤体外3D模型显示，DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic和DTX@ALN-(HA32k)CL-Pluronic可以有效抑制3D模型中耐DTX肿瘤细胞增殖和破骨细胞生成，减少骨陷窝数量，发挥抑制耐DTX肿瘤细胞增殖和抗骨重吸收双重作用。　　7.荷瘤裸鼠体内研究结果表明，DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic可以有效抑制骨转移瘤的生长。活体成像结果显示，载药胶束对骨转移瘤有显著的靶向作用。micro-CT结果显示，DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic给药组骨转移瘤部位的骨密度（BMD）明显高于生理盐水组和游离DTX给药组，说明DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic能有效抑制骨转移瘤导致的骨重吸收。H&E染色结果显示载药胶束对肿瘤组织毒性强，而对其他正常组织器官无明显损伤。　　8.DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic和DTX@ALN-(HA32k)CL-Pluronic均可增加肿瘤细胞中bax和cleaved caspase-3蛋白表达，降低P-gp和bcl-2蛋白表达，上述蛋白的变化与其抗肿瘤以及逆转DTX耐药活性有关。体内实验结果表明，胶束给药后，耐DTX肿瘤组织中P-gp、bcl-2、bax和cleaved caspase-3蛋白表达与体外结果相似。此外，胶束给药后，耐DTX肿瘤组织中OPG蛋白表达较DTX给药组明显上升，NF-κB、TGFβ1和RANKL蛋白表达则显著降低。　　结论：　　DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic具有pH敏感性、还原响应性和骨转移瘤靶向性，能够有效抑制耐DTX骨转移瘤的生长及骨重吸收，提高了DTX对耐DTX骨转移瘤的治疗效果。DTX@ALN-(HA6k)CL-Pluronic抑制耐DTX骨转移瘤生长和骨重吸收的作用与提高骨转移瘤组织bax、cleaved caspase-3和OPG蛋白表达，降低P-gp、NF-κB、TGFβ1和RANKL蛋白表达有关。