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猪圆环病毒病(Porcine Circovirus disease,PCVD)是危害全球养猪业的重大疾病,也是威胁我国养猪业健康发展的重大疾病之一。猪圆环病毒2型(Porcine CircovirusType2,PCV-2)急性感染会损害猪的免疫系统,造成免疫系统紊乱,最终导致死亡率急剧上升,给养猪业造成了巨大的经济损失,同时该病毒可与其他多种病原混合感染。目前由于缺乏控制该病的有效药物,因此接种疫苗是当前防控该病最有效的方式。抗原制备是疫苗制造的首要环节,也是决定疫苗质量的关键因素。目前国内大多数兽用生物制品企业依然采用传统的转瓶生产工艺进行动物疫苗的生产,这种生产工艺制备的疫苗不可避免会出现产品批间差异大、质量稳定性不佳及抗原效价低等缺点,已无法满足当前对高质量动物疫苗的需求。在这种情形下,建立以生物反应器技术为基础的动物细胞大规模培养技术将成为动物疫苗生产的主流模式。本研究采用细胞生物反应器技术生产PCV-2抗原,对培养过程中的各项技术条件进行优化,为PCV-2抗原的大规模生产提供可靠的参考依据,并对应用该工艺制备的疫苗进行质量评价研究。1.PK-15细胞悬浮培养猪圆环病毒2型(YZ株)增殖工艺研究为了建立猪圆环病毒2型的细胞悬浮培养工艺以提高PCV-2抗原效价,以NBS-7.5L反应器片状载体悬浮培养PK-15细胞,对细胞接种数量、生物反应器转速、病毒接种时间和病毒接种剂量等条件进行了优化。结果表明,利用NBS-7.5L(含250g片状载体)生物反应器悬浮培养’细胞在血清含量为100%,反应器转速不低于40rpm,细胞初始接种量为(1±0.2)X109等条件下生长状态最好,且细胞的生长情况与葡萄糖消耗量之间存在正相关性;细胞培养至第7d以0.1MOI的剂量接种病毒,接毒后72h病毒增殖达到峰值,病毒含量为106.5TCID50/mL。上述结果表明利用悬浮培养工艺,可以制备高滴度的PCV-2,为载体条件下大规模生产PCV-2(YZ株)奠定了一定的基础。2.猪圆环病毒2型YZ株灭活条件的筛选选择环化后终浓度为0.2 ‰、0.5‰、1.0 ‰的BEI对猪圆环病毒2型YZ株病毒液进行灭活比较研究,经安全性试验和免疫效力试验检验表明:0.2‰的BEI在32℃条件下72h不能完全灭活病毒,0.5%0BEI在32℃条件下48h即可将病毒灭活,考虑到大生产过程中的复杂性,为确保病毒灭活完全,拟确定生产时最佳灭活浓度为1.0‰BEI在32℃条件下灭活48h。使用浓度为2.0‰的甲醛溶液及环化后终浓度为1.0‰的BEI溶液分别对猪圆环病毒2型YZ株(PCV-2 YZ株)病毒液进行灭活。经灭活检验合格的样品,最终乳化为灭活疫苗。不同灭活剂所制备疫苗的动物试验结果表明,BEI灭活疫苗及甲醛灭活疫苗对仔猪均具有较好的安全性,但BEI灭活疫苗在诱导动物机体产生抗体的时间和抗体效价达到峰值的时间方面均优于甲醛灭活疫苗。3.猪圆环病毒2型灭活疫苗(YZ株)安全性及免疫效力试验研究选取实验室试制并经初步检验合格的3批猪圆环病毒2型(YZ株)灭活疫苗,批号为YH-001、YH-002、YH-003,分别进行断奶仔猪和怀孕母猪的单倍剂量、双倍剂量和单倍剂量重复接种的安全性试验评价。接种后21d试验结果显示,所有接种的猪只均未出现异常的临床症状,试验组猪体重与对照组猪体重之间不存在显著性差异,这表明试制的疫苗对断奶仔猪和怀孕母猪均安全。将3批次(YH-001、YH-002、YH-003)疫苗免疫断奶仔猪和母猪,首免后3周再进行加强免疫。二免后2周用4×105.0TCID50 PCV-2(YZ株)攻毒,攻毒后28日,疫苗免疫组猪均未发病,保护率为100%(5/5),非免疫攻毒组5/5发病,非免疫非攻毒组5/5健活,发病猪主要表现为体温升高、平均相对日增重与对照组相比差异显著、攻毒后28d猪出现病毒血症和免疫组化检测阳性。结果表明该疫苗免疫断奶仔猪,二免后2周产生的血清IFA抗体不低于1:600;免疫母猪所产仔猪哺乳后1周即能获得高水平的血清IFA抗体滴度,抵抗PCV-2的感染,疫苗免疫效果显著。4.猪圆环病毒2型灭活疫苗(YZ株)免疫后抗体水平与免疫保护相关性及抗体消长规律研究将实验室试制的猪圆环病毒灭活疫苗稀释成不同抗原含量分别对仔猪和后备母猪进行免疫。血清抗体效价与攻毒保护相关性试验表明:当血清IFA抗体效价达到1:500时,猪体即可获得100%的免疫保护,同时也证明免疫后血清抗体水平与攻毒保护率呈正相关,说明免疫后检测血清IFA抗体水平可以作为猪圆环病毒灭活疫苗的免疫效果评价手段之一。将本公司试制的3批猪圆环病毒灭活疫苗进行了疫苗免疫持续期试验,用YH-001、YH-002、YH-003进行疫苗免疫断奶仔猪抗体消长规律检测。间接免疫荧光(IFA)检测抗体结果显示:3批次灭活疫苗免疫断奶仔猪后均能迅速产生免疫应答,并能产生较高水平的IFA抗体,二免后2周左右血清IFA抗体效价达1:600～1:900,个别能达到1:1000;免疫后6个月血清中平均抗体不低于1:500,免疫后8个月时的平均抗体水平在1:420～480之间。上述研究结果表明,以动物细胞大规模培养技术为基础制备猪圆环病毒2型细胞灭活疫苗(YZ株),完全可以替代传统转瓶工艺制备的PCV2灭活疫苗进行PCV-2传染病的防控。